ZMNH Core Facility Bioanalytik

Die ZMNH Core Facility Bioanalytik ist ausgestattet mit einem ABI PRISM Genetic Analyzer und zwei 7900 HT RT-PCR Geräten. Der hier angebotene Service umfasst die Durchführung von Sanger-Sequenzreaktionen, die anschließende Aufreinigung und Analyse mit einem ABI PRISM Genetic Analyzer sowie gegebenenfalls die Durchführung von Fragment Analysen. Für real time PCR Versuche stehen zwei 7900 HT Geräte zur Verfügung. Als Serviceleistung werden - typischerweise für transgene Mäuse - Genotyp Bestimmungen mit Hilfe von High Resolution Melting, RT-PCR und Copy Number Variation Assays durchgeführt. Die jeweiligen Assays werden im Bedarfsfall entworfen und etabliert.

Serviceleistungen

  • Die Proben DNA soll möglichst sehr sauber sein: Die Qualität der DNA korreliert direkt mit der Qualität der Sequenz. Die abgegebenen Proben sollen ca. 500 ng DNA (für durchschnittliche Plasmide), 5 – 10 pmol primer und Wasser in einem Endvolumen von 8 µl enthalten. Bitte darauf achten, dass die Probe möglichst kein EDTA enthält! Die Ergebnisse werden elektronisch übermittelt, zusätzlich können auch Ausdrucke ausgegeben werden

  • In Kooperation mit dem Auftraggeber können Assays für die Fragment Analyse (z. Bsp. Spectratyping) entworfen und durchgeführt werden, die Abrechnung orientiert sich an den aufgewendeten Materialkosten.

  • Folgende Anwendungen können an unseren Geräten durchgeführt werden:

    • absolute quantification (includes CNV assays)

    Vorgehensweise: Bitte rechtzeitig für die geplanten Läufe anmelden und die Telefonnummer angeben. Bitte eigene “Optical Cover Compression Pads” mitbringen! Bitte nicht vergessen, die Platte nach Beendigung des Laufs aus dem Gerät zu entfernen.

    • relative quantification

    • end-point analysis: allelic discrimination, SNP detection

    Vorgehensweise:

    Bitte rechtzeitig für die geplanten Läufe anmelden und die Telefonnummer angeben.

    Bitte eigene “Optical Cover Compression Pads” mitbringen!

    Bitte nicht vergessen, die Platte nach Beendigung des Laufs aus dem Gerät zu entfernen.

  • Die HRM (High Resolution Melting) Analyse kann zwischen DNA Sequenzen diskriminieren basierend auf Unterschieden in ihrer Komposition, ihrer Länge, ihrem GC – Gehalt oder der Strang Komplementarität, das heißt, wenn zwei Mauslinien beispielsweise sich durch das Vorliegen eines Basenaustauschs, einer Deletion oder Insertion in einem bestimmten Gen unterscheiden, so ist dies nach Amplifikation des relevanten Genabschnitts mittels der Schmelzkurvenanalyse nachweisbar.

    Im C57BL/6N-Sub Stamm vorliegende Mutationen/Abweichungen, die hier als Service analysiert werden:

    • Crb1rd8 Chang et al., und Mattapallil et al.

    • Cyfip2B6N/– Kumar et al.

    • Nnt Mekada et al., hier liegt im J-Sub Stamm eine 11 kb Deletion vor

    Eine weitere Möglichkeit zur molekulargenetischen Charakterisierung von Mausstämmen liegt in der Bestimmung von Copy Number Variations (CNV), also größeren DNA Abschnitten, die in unterschiedlicher Kopien Zahl vorliegen können. Ebenso kann über solche Assays abgeschätzt werden, ob ein bestimmtes Transgen als einfacher Abschnitt, wie im heterozygoten Fall, oder als doppelter Abschnitt, also homozygot, vorliegt. Entsprechende Assays können auf Wunsch etabliert und durchgeführt werden.

    References:

    Chang B, Hawes NL, Hurd RE, Davisson MT, Nusinowitz S, Heckenlively JR. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 2002; 42: 517 - 525

    Mary J. Mattapallil, Eric F. Wawrousek, Chi-Chao Chan, Hui Zhao, Jayeeta Roychoudhury, Thomas A. Ferguson, and Rachel R. Caspi. The Rd8 Mutation of the Crb1 Gene Is Present in Vendor Lines of C57BL/6N Mice and Embryonic Stem Cells, and Confounds Ocular Induced Mutant Phenotype. Investigative Ophthalmology & Visual Science, May 2012, Vol. 53, No. 6

    Vivek Kumar, Kyungin Kim, Chryshanthi Joseph, Saïd Kourrich, Seung-Hee Yoo1, Hung Chung Huang1, Martha H. Vitaterna, Fernando Pardo-Manuel de Villena, Gary Churchill, Antonello Bonci, Joseph S. Takahashi. C57BL/6N Mutation in Cytoplasmic FMRP interacting protein 2 Regulates Cocaine Response. Science, December 2013, Vol. 342 no. 6165 pp. 1508-1512.

    Mekada K, Abe K, Murakami A, Nakamura S, Nakata H, Moriwaki K, Obata Y, Yoshiki A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 2009 Apr;58(2):141-9.

  • Die Facility bietet Beratung zu Sequenzierungen und Sequenzdaten Analysen an, sowie zu verschiedenen Aspekten der Planung und Durchführung von RT-PCR Experimenten.

Downloads

Kontakt

PD Dr. rer. nat. Dipl.-Biol. Sabine Hoffmeister-Ullerich und Marion Hohlbaum

ZMNH Core Facility Bioanalytik

Raum 1.21 und 1.22, 1. OG

Tel.: +49 (0) 40 7410 - 56659 und - 56662

E-Mail: hoffmeis@zmnh.uni-hamburg.de