UKE - II. Medizinische Klinik und Poliklinik

Prof. Dr. med.

Martin Trepel

Facharzt

Facharzt für Innere Medizin
Facharzt für Hämatologie - Internistische Onkologie

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AG Rezeptortargeting

Leitung: Prof. Dr. Martin Trepel
II. Medizinische Klinik und Poliklinik
Onkologie, Hämatologie, Knochenmarktransplantation mit der Sektion Pneumologie

Kontakt:
Prof. Dr. med. Martin Trepel
Telefon: (040) 7410 -51980
Email: m.trepel@uke.de

Prof. Dr. med. Jakob Körbelin
j.koebelin@uke.de

Jutta Bode
Telefon: 0175-4151061
Email: j.bode@uke.de

Arbeitsgebiet:
Identifikation und Charakterisierung Zelltyp-spezifischer Membranproteine und ihrer Liganden.

Forschungsschwerpunkte:
Alle Zelltypen und Gewebe des Körpers, einschließlich krankhaft veränderten Gewebes wie beispielsweise Tumoren, tragen für das jeweilige Gewebe spezifische Zelloberflächenproteine ("Rezeptoren"). Der Schwerpunkt der Arbeitsgruppe liegt in der Identifizierung solcher zell-, organ- oder tumorspezifischer Rezeptoren. Diese ermöglichen gewebe- oder zelltypspezifische Therapieansätze, wobei Wirkstoffe oder Organismen spezifisch auf erkranktes Gewebe gelenkt werden können, um dort zielgerichtet einen hohen Wirkungsgrad zu erreichen, während gesundes Gewebe von Nebenwirkungen verschont bleibt. Darüber hinaus ermöglicht die Identifikation von zelltypspezifischen Rezeptoren und ihrer Liganden ein tieferes Verständnis für die Interaktion von Tumorzellen mit ihrer Umgebung. Dadurch können krankheitsbeeinflussende Stimulationen aus der Umgebung erkannt und das Bild der Pathophysiologie bestimmter Tumoren erweitert werden.
Besondere Schwerpunkte der Arbeitsgruppe liegen derzeit auf der Untersuchung bestimmter Zelloberflächenrezeptoren von bösartigen hämatopoetischen Zellen, insbesondere Lymphomzellen, sowie auf der Entwicklung zielzellspezifischer Gentherapievektoren auf der Basis von Adeno-assoziierten Viren.

Adeno-Assoziierte Viren als Genvektoren

Die Entwicklung einer zielgerichteten (zielzellspezifischen) Gentherapie Der therapeutische Gentransfer durch rekombinante virale Vektoren zur Korrektur hereditärer oder erworbener Erkrankungen hat in den letzten Jahren trotz kontroverser Diskussionen großes Potential gezeigt. Dennoch hat sich dabei die fragliche Effektivität und die mangelnde Sicherheit der bisher in klinischen Studien verwendeten Gentherapievektoren als ein führendes, vielleicht sogar das entscheidendste Problem in der praktischen Anwendung ergeben. Die verfügbaren Vektoren müssen verbessert werden, weil sie z.T. Immunreaktionen auslösen, viele Zellen und Gewebe unerwünscht transduzieren, gleichzeitig aber Zellen im Verband des Zielgewebes, z.B. in malignen Tumoren, nicht ausreichend effektiv transduzieren.
Rekombinante adeno-assoziierte Viren (AAV) zeigen sich zunehmend als eines der vielversprechensten Vektorsysteme, da sie eine hohe und langanhaltende Genexpression in einer Vielzahl von Zellen und Geweben ermöglichen und nach heutigem Wissensstand keine pathogenen Eigenschaften haben.
Wir beschäftigen uns vor allem mit der Frage nach der Interaktion zwischen AAV-Kapsid und Rezeptoren auf der Zielzelle. Ziel unserer Forschung ist es, durch Insertion eines Peptidliganden in die rezeptorbindende Domäne des AAV Kapsids zelltyp- bzw. gewebsspezifische AAV-Vektoren zu entwickeln. Hierzu nutzen wir sogenannte randomisierte AAV-Peptidbanken zur Selektion viraler Kapside mit neuen Zellbindungs- und Infektionseigenschaften. Dies sind Kollektionen von bis zu 109 unterschiedlichen AAV-Kapsiden, die an ihrer Oberfläche ein jeweils für das Kapsid einzigartiges, in der Sequenz zufällig zusammengestelltes Peptid tragen, das die Bindung an und Internalisierung in eine bestimmte Zielzelle vermitteln kann, wenn eine passende Aminosäuresequenz vorliegt (ABB. 1).

Abbildung 1

Abbildung 1:
Kapsid von adeno-assoziiertem Virus mit Vergrößerung (Ausschnitt rechts) der rezeptorbindenden Kapsiddomäne (Müller et al., Nature Biotechnology, 2003). Gezeigt ist in blau die Insertion eines Targetingpeptids auf der Basis einer von uns entwickelten Technologie, mit Hilfe dessen das Kapsid an zelltypspezifische Rezeptoren binden kann.

Abbildung 2

Abbildung 2a

In einer Art zeitgerafftem Evolutionsprozess werden dann die Vektorkapside herausselektiert, die die Zielzellen oder das Zielgewebe (z.B. Tumoren) transduzieren können. Diese neuen Vektoren, die für diese Eigenschaft selektiert wurden, werden dann mit therapeutischen Genen in präklinischen Studien (z.B. in Tumormodellen) erprobt (Abbildung 2).

Abbildung 2:
Zielgerichteter Gentransfer mittels adeno-assoziierter viraler Vektoren. Intravitales Imaging der Luziferase Genexpression nach systemischer Injektion von kapsidmodifizierten AAV. Der durch den Vektor vermittelte Gentransfer wird durch farbliche Markierung kenntlich gemacht. Während Vektoren mit Wildtyp- (also unmodifiziertem) AAV-Kapsid vor allem die Leber transduziert (links), ermöglichen die von uns etablierten tumorspezifische AAV-Kapside eine selektive Transduktion des Tumorgewebes in einem transgenen Mammakarzinom-Modell (Abbildung 2a). (aus Michelfelder et al. PlosOne 2011)

Weitere aktuelle Projekte beschäftigen sich mit der Entwicklung von AAV Expressionskassetten zur Optimierung der Zelltyp-Spezifität der neu entwickelten Vektoren (spezifische Promotoren, shRNA, microRNA), sowie mit der Entwicklung von AAV-Vektoren mit zytotoxischen Genen zum therapeutischen Einsatz bei Tumorerkrankungen. Desweiteren arbeiten wir an der Weiterentwicklung des AAV-Peptidbanksystems in verschiedenen AAV-Varianten.

Tumorspezifische Rezeptoren und Liganden

Ein Schwerpunkt der Arbeitsgruppe liegt auf der Charakterisierung von B-Zell-Rezeptoren maligner Lymphome (Lymphdrüsenkrebs). B-Zell-Rezeptoren sind zellklonspezifische Immunglobuline, die in gesunden B-Lymphozyten (als Antigen-erkennender Rezeptor), aber auch bei der Mehrzahl aller Lymphomarten auf den Tumorzellen membranständig präsentiert werden. Dabei tragen alle Tumorzellen eines individuellen Lymphompatienten den gleichen B-Zell-Rezeptor, der sich aber wiederum auf praktisch keiner anderen Körperzelle findet. Der B-Zell-Rezeptor ist also eine vollständig tumorspezifische Struktur, die somit auch von Patient zu Patient variiert. In den letzten Jahren erkennt man zunehmend die sehr wichtige Bedeutung, die der B-Zell-Rezeptor in der krankhaften Entwicklung von der normalen lymphatischen Zelle zur Lymphomzelle hat. Bei vielen Lymphomarten wird das Wachstum und Überleben der Tumorzellen wahrscheinlich entscheidend durch diesen Rezeptor gesteuert. Da der Rezeptor von Natur aus als Antigenrezeptor fungiert, untersuchen wir, welche Epitope in welchen Antigenen von verschiedenen Lymphomzellen erkannt werden. Zudem erarbeiten wir Strategien, wie man diesen tumorspezifischen Rezeptor für eine zielgerichtete Therapie von Lymphomen einsetzen kann.
Wir konnten für die chronische lymphatische Leukämie (CLL) zeigen, dass die Leukämie- bzw. Lymphomzellen eines Großteils der Patienten ähnliche Epitope binden. Daraus kann man folgern, dass es nur eine geringe Anzahl verschiedener Antigene gibt, die durch B-Zell-Rezeptoren von CLL-Zellen unterschiedlicher Patienten erkannt werden. Für eineUntergruppe von CLL Patienten zeigten wir, dass die B-Zell-Rezeptoren ihrer Tumorzellen das Protein Vimentin als Antigen erkennen, das von Stromazellen, wie sie auch im Lymphknoten und Knochenmark vorkommen, präsentiert wird (s. Abbildung 1).
Aus diesen und anderen Beobachtungen leitet sich die Vermutung ab, dass ein Stimulus über den B-Zell Rezeptor ein Tumorwachstum fördert und damit ein wichtiger therapeutischer Angriffspunkt darstellt. Darüberhinaus stellt sich die Frage, ob dieser Antigenstimulus nicht auch in der Entstehung der Erkrankung eine entscheidende Rolle spielen könnte.

Abbildung 4

Abbildung 4: Der membranständige B-Zell Rezeptor von CLL-Zellen (Ig014) erkennt Vimentin, das von Stromazellen (hierM210B)präsentiert wird. Die Zellen wurden zunächst mit rekombinant hergestelltem B-Zellrezeptor (Ig014) als Primärantikörper und sekundär mit einem FITC gekoppelten anti-humanen IgG (grün) gefärbt. Gegenfärbung erfolgte mit Alexa Fluor -594 Phalloidin (rot). Die untere Bildreihe ist eine Vergrößerung der oberen. Die Färbung zeigt ein identisches Muster wie mit einem anti-Vimentin-Antikörper (aus Binder et al.,PLOSOne 2010).

Über die Frage der Entstehung und Stimulierung eines Lymphoms über den B-Zell Rezeptor hinaus nutzen wir diesen auch als eine therapeutische Zielstruktur. Therapeutika können auf unterschiedliche Art auf Zielrezeptoren gelenkt werden. Hierdurch kann man eine zielgerichtete Wirkung erreichen und gleichzeitig gesundes Gewebe vor unerwünschten Nebenwirkungen bewahren. Wir nutzen hierfür z.B. Peptide, die selektiv an den B-Zell Rezeptor binden. Diese Peptide identifizieren wir mit Hilfe von randomisierten Phagenpeptidbanken auf den oben beschriebenen rekombinant hergestellten B-Zell Rezeptoren. Therapeutisch nutzen wir im Anschluss einen physiologischen Effekt innormalen und bösartigen B-Zellen aus, die auf eine durch polyvalente Bindung induzierte Quervernetzung ihres B-Zell-Rezeptors mit Apoptose, dem programmierten Zelltod, reagieren. Hierfür tetramerisierten wir ein identifiziertes Peptid und konnten damit in einem Lymphommodell in vivo einen deutlichen therapeutischen Effekt erreichen (s. Abbildung 2). Aktuell werden weitere therapeutische Ansätze evaluiert.

Abbildung 5

Abbildung 5: Reduktion der Tumorlast (Lymphomzellen) in einem in vivo-Modell des sehr aggressiven Burkitt-Lymphoms SupB8 durch tetramerisierte, selektiv den B-Zell-Rezeptor des Lymphoms bindende Peptide. (a) Beispieleiner FACS-Analyse von Lymphomzellen befallenemKnochenmark. Die Färbung erfolgte mit anti-murinem anti-CD45-APC, anti-humanem CD19-PE und einem anti-human lambda Leichtketten Antikörper. (b) Darstellung der prozentualen Anteile an Lymphomzellen unter Therapie mit tetramerisiertem, selektiv den B-Zell Rezeptor von SupB8-Lymphomzellen erkennenden Peptid (Epitop-Mimic) und Kontrollen. Aus Wehr et al.,Int J. Cancer2012.