Methoden

  • Durchflusszytometrie
  • Zytomorphologie
  • Molekulargenetik

Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ist eine Laborverfahrenstechnik, mit der die Eigenschaften einzelner Zellen oder Partikel in einer Flüssigkeit schnell und gleichzeitig in mehreren Parametern untersucht werden können. Sie wird in den PHO-Diagnostiklaboren im Wesentlichen für zwei Zwecke eingesetzt: Der eine Bereich ist die Immunphänotypisierung von Leukämien sowie selten soliden Tumoren und die Diagnostik der minimalen Resterkrankung (MRD) von Leukämien. Der zweite Bereich betrifft eine breite Diagnostik von immunologischen Erkrankungen (z.B. angeborene Immundefekte oder Autoimmunerkrankungen) und Blutstammzelltransplantation: Es erfolgen durchflusszytometrische (auch funktionelle) Analysen von Lymphozytensubpopulationen (Immunstatus) und myeloiden Zellen, sowie der Zusammensetzung von Knochenmark-/Stammzellprodukten. Therapiebegleitend wird die Immunrekonstitution nach Stammzelltransplantation analysiert und ein Monitoring von CAR-T-Zellen nach CAR-T-Zellinfusion durchgeführt. Bei HLA-disparaten Blutstammzelltransplantationen kann auch der Anteil der Spenderzellen durchflusszytometrisch bestimmt werden (FACS-Chimärismus). Eine spezielle Anwendung bietet die FlowFISH-Analyse, hier können über den Nachweis von EBER-RNA EBV-infizierte Lymphozyten detektiert werden.

Analysen Durchflusszytometrie

  • Bei Verdacht auf das Vorliegen einer Leukämie werden Blut oder Knochenmark nach Markierung mit Antikörpern durchflusszytometrisch analysiert. Zur Klassifikation der entsprechenden Erkrankung werden Antikörper gegen folgende Marker eingesetzt (Oberflächenmarker, sofern nicht anders gekennzeichnet):

    B-lymphatische Marker: CD10, CD19, CD20, CD22 (auch intrazellulär), CD24, CD38, CD79a (intrazellulär), IgM (auch intrazellulär), Kappa, Lambda, Terminale Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT, intrazellulär);

    T-lymphatische Marker: CD1a, CD2, CD3 (auch intrazellulär), CD4, CD5, CD7, CD8, CD48, TCRαβ, TCRγδ; myeloide Marker CD13, CD14, CD15, CD33, CD36, CD41a, CD42b, CD61, CD64, CD117,

    Myeloperoxidase (MPO, intrazellulär);

    Marker für hämatopoetische Vorläuferzellen: CD34, CD45;

    Aktivierungsmarker lymphatischer Zellen (häufig in Coexpression mit anderen Zellen): CD52, CD56, CD99, HLADR;

    Spezifische Tumormarker: GD2, NG2.

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  • Der EMA-Test wird zur Diagnostik der hereditären Sphärozytose eingesetzt. Membranproteine der roten Blutkörperchen (Erythrozyten), z.B. das Protein Band-3, werden durch Bindung des Farbstoffs Eosin-5-Maleimid angefärbt. Durchflusszytometrisch wird gemessen, wie stark die Zellen fluoreszieren. Ist die Fluoreszenzintensität des Farbstoffs verringert, weist dies auf einen Defekt und das Vorliegen einer Sphärozytose hin. W

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  • Die durchflusszytometrische Untersuchung von Knochenmarksproben wird in unserem Labor im Rahmen der CoALL-Studiengruppe, unter anderem in der ALLTogether Studie angewandt, um das Therapieansprechen im Sinne der MRD zu messen. Wie die molekulare MRD ist die durchflusszytometrische Quantifizierung (FLOW-MRD) von residualen Leukämiezellen im Knochenmark stratifizierungsrelevant und beeinflusst die Entscheidung ob Therapien intensiviert oder reduziert werden können. Anhand des initialen Leukämiematerials aus Knochenmark oder Blut wird der leukämieassoziierte Immunphänotyp bestimmt. Im Verlauf der Therapie wird zu definierten Zeitpunkten Heparin-Knochenmark analysiert und die Zellen des bekannten Phänotyps quantifiziert.

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  • Bestimmung der Lymphozyten-Subpopulationen (CD3+ T-, CD19+ B- und CD56/16+ NK Zellen, inklusive aktivierte T-Zellen (HLA-DR+)) im peripheren Blut zur Diagnose oder zum Ausschluss von Immundefekten, zur Bestimmung der Immunrekonstitution nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation und zum Monitoring nach Antikörpertherapie (z. B. B-Zellzahl nach Rituximab).

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  • Bei Verdacht auf Vorliegen einer Erkrankung oder für den Ausschluss einer Erkrankung, die mit Veränderungen der B-Lymphozyten einhergeht, wie z. B.: Immundefekte, Immunglobulinmangel-Syndrome, Common Variable Immunodeficiency (CVID) oder andere Erkrankungen, die mit polyklonalen Hypergammaglobulinämien einhergehen, z. B. systemischer Lupus erythematodes. Die B-Zell-Differenzierung erfolgt ausschließlich in Kombination mit der Bestimmung eines Immunstatus (bitte beides einzeln anfordern). Innerhalb der Population der B-Lymphozyten werden über weitere Differenzierungsmarker (CD20, CD21, CD24, CD27, CD38 und IgD) die B-Zell-Subpopulationen charakterisiert.

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  • Bei Verdacht auf Vorliegen einer Erkrankung oder für den Ausschluss einer Erkrankung, die mit Veränderungen der T-Lymphozyten einhergeht. Dazu gehören z. B.: Immundefekte mit reduzierter Anzahl an T-Subpopulationen: T- SCID, DiGeorge Syndrom MST1/STK4 Defizienz; Immundefekte mit erhöhter Anzahl an T-Subpopulationen: HLH, DOCK8 Defizienz oder Virusinfektionen. Die T-Zellreifung erfolgt ausschließlich in Kombination mit der Bestimmung eines Immunstatus (bitte beides einzeln anfordern). Innerhalb der Population der T-Lymphozyten werden über weitere Differenzierungsmarker (CD4, CD8, CD45RA, CD45R0, CD27 und CD31) die T-Zell-Subpopulationen charakterisiert.

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  • Bei Verdacht auf Vorliegen einer Erkrankung oder für den Ausschluss einer Erkrankung, die mit Veränderungen (meist Erhöhung) der DNTs einhergeht, wie z. B.: ALPS (Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome), FADD Defizienz, RALD. Die Bestimmung der DNT erfolgt ausschließlich in Kombination mit der Bestimmung eines Immunstatus (bitte beides einzeln anfordern). Innerhalb der T-Lymphozyten werden über weitere Differenzierungsmarker (CD4, CD8, CD56, TCRαβ und TCRγδ) die DNTs gemessen.

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  • Bei Verdacht auf Vorliegen einer Erkrankung oder für den Ausschluss einer Erkrankung, die mit Veränderungen der Tregs einhergeht, wie z. B.: Immundefekte, Immundysregulation (z. B. IPEX (Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome), CD25 Defizienz) oder Chronisch-entzündliche Erkrankungen, z. B. JIA (Juvenile idiopathische Arthritis). Regulatorische T-Zellen werden ausschließlich in Kombination mit einem Immunstatus bestimmt (bitte beides einzeln anfordern). Innerhalb der T-Lymphozyten werden über weitere Differenzierungsmarker (CD4, CD8, CD25 und CD127) die Tregs charakterisiert.

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  • Bei Verdacht auf Vorliegen einer Erkrankung oder für den Ausschluss einer Erkrankung, die mit Veränderungen der TH17 Zellen einhergeht, wie z. B. reduzierte Anzahl an TH17 Zellen bei Chronischer Mukokutaner Candidiasis (CMC), durch CARD9 Defizienz, IL-17F und IL17RA Mutationen oder STAT1 gain-of-function Mutationen; Hyper IgE Syndrom (HIES), durch STAT3 Defizienz, DOCK8 Defizienz; APECED mit neutralisierenden Antikörpern gegen IL-17 und IL-22 oder durch AIRE Defekt. Eine erhöhte Anzahl an TH17 Zellen kann bei ADAM Mutationen, z. B. ADAM9 und ADAM17, Psoriasis, Rheumatoider Arthritis oder Chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen auftreten. Der Anteil der TH17 Zellen innerhalb der CD4+CD45R0+ T-Zellen wird nach Stimulation mit PMA und Ionomycin anhand der Oberflächenmarker CD3, CD4, CD45R0, CCR6 und der intrazellulären Anfärbung der Zytokine IL-17(A) und IFNγ bestimmt.

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  • Bei Verdacht auf Vorliegen einer Erkrankung oder für den Ausschluss einer Erkrankung, die mit einer eingeschränkten T-Zell-Proliferation einhergeht, wie z. B.: Immundefekte, Ataxia teleangiectatica, CHARGE Syndrom, DOCK2 Defizienz (geringe Proliferation nach PHA-Stimulation), WAS, MAGT1, RhoH, BCL10 Defizienz (geringe Proliferation nach CD3-Stimulation), LCK, IKBKB Defizienz (geringe Proliferation nach TCR-Stimulation), CARD11, MST1 Defizienz (insgesamt geringe Proliferation). Periphere mononukleäre Zellen (PBMC) werden mit verschiedenen T-Zell-aktivierenden Agenzien stimuliert (Mitogen-, TCR-abhängig) und die Proliferation der CD4+ und CD8+ T-Zellen nach 6 Tagen durchflusszytometrisch bestimmt.

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  • Bestimmung der Expression der Adhäsionsmoleküle CD11a, CD11b, CD11c, CD15 und CD18 auf Granulozyten im peripheren Blut. Bei Verdacht auf Vorliegen einer Erkrankung oder für den Ausschluss einer Erkrankung, die mit Veränderungen der Adhäsionsmolekülexpression einhergeht, wie z. B.: Leukocyte adhesion deficiency (LAD) syndrome, LAD I (ITGB2): Fehlende oder reduzierte CD11b und CD18 Expression, LAD II (SLC35C1): Fehlende oder reduzierte CD15 Expression.

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  • Quantitative Bestimmung des oxidativen Bursts und qualitative Bestimmung der Phagozytose von Granulozyten im peripheren Blut. Der Test basiert auf der Messung des respiratorischen Bursts von neutrophilen Granulozyten nach Stimulation mit E. coli Bakterien. Während der Ingestion der Bakterien aktivieren Phagozyten die NADPH-Oxidase, die wiederum reaktive Sauerstoffmetabolite produzieren (= respiratorischer Burst). Durch Zugabe von Dihydrorhodamine 123 (DHR123) kann dieser Prozess verfolgt werden. Die durch den Burst entstehenden Hypochloridionen oxidieren DHR123 in fluoreszentes Rhodamin 123, das durchflusszytmetrisch analysiert werden kann. Eine Positivkontrolle wird parallel mit PMA (Phorbal-12-myristate-13-acetate) stimuliert, was den respiratorischen Burst ohne Adhäsion und Ingestion von Pathogenen aktiviert. Bei Verdacht auf Vorliegen oder Trägerschaft einer Erkrankung oder für den Ausschluss einer Erkrankung, die mit Veränderungen der Burstaktivität einhergeht, wie z. B.: Septische Granulomatose (CGD: chronic granulomatous disease), X-CGD (CYBB, Mutation des gp91-phox Gens), Autosomale CGDs: CYBA, NCF1, NCF2, G6PD-Defizienz (Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel, X-chromosomal) und zur Beurteilung von Medikamenteneffekten.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Durchflusszytometrische Bestimmung des Spender- und Empfängerzellanteils nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation bei HLA-Disparität mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, CD56, CD14 und einem patienten/empfängerspezifischen anti HLA-Antikörper.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer.

  • Durchflusszytometrische Bestimmung des Anteils an CD19 CAR-exprimierenden T-Zellen (z.B. Yescarta®, Kymriah®) beim Empfänger.

    Am Tag der Infusion wird die Vitalität und Identität des CAR-T-Zell Produktes bestimmt, im Verlauf erfolgt die Quantifizierung der CAR-T-Zellen mit einer parallelen Analyse der T-Zell-Differenzierung oder T-Zell-Exhaustion. Zusätzlich wird die B-Zellzahl sensitiver als im Immunstatus bestimmt.

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  • Durchflusszytometrische Bestimmung der absoluten und relativen Anzahl an Leukozyten, MNC, CD34+-Stammzellen und CD3+-T-Zellen aus Knochenmark oder Apheresat. Qualitätskontrolle des Knochenmark-/Stammzellproduktes. Nur für UKE-Patienten verfügbar.

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  • Bei Verdacht auf EBV-infizierte Lymphozyten im peripheren Blut, die zur einer hämophagozytischen Lymphohistiozytose (HLH) und/oder einem T/NK-Zell-Lymphom führen können.

    Der Nachweis von EBER-RNA in Lymphozyten erfolgt durchflusszytometrisch mit Hilfe von RNA-spezifischen Sonden, gefolgt von einer mehrstufigen Signalamplifikation. Die Lymphozytenoberfläche wird zusätzlich mit Antikörpern gegen CD45, CD3, CD56 und CD19 (oder CD20) gefärbt.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Qualitative und quantitative (MFI) durchflusszytometrische Bestimmung von Oberflächenmarkern die auf aktivierten myeloiden Zellen im peripheren Blut exprimiert werden. Zur Diagnose oder Ausschluss einer viralen und/oder bakteriellen Infektion oder Interferonopathien. Myeloide Zellen, zu denen Monozyten, Makrophagen, Neutrophile Granulozyten oder Dendritische Zellen zählen, werden durch Kontakt mit Pathogenen aktiviert und setzen verschiedene pro-inflammatorische Mediatoren wie Zytokine und Interferone (IFNs) frei. Die Freisetzung dieser Mediatoren geht mit der Expression spezifischer Moleküle auf der Oberfläche der Immunzellen einher. Siglec-1 (CD169, Sialoadhesin) wird nach viraler Infektion und der Ausschüttung von Typ 1 Interferonen auf Monozyten hochreguliert, CD64 (FCGR1A) wird nach bakterieller Infektion und der Ausschüttung von Typ II Interferonen auf Neutrophilen hochreguliert, PDL1 (CD274) wird nach bakterieller Infektion und der Ausschüttung von Typ II Interferonen auf Monozyten hochreguliert.

    In besonderen Fällen kann auch ein Stimulationsassay im Labor angefragt werden, bei dem die Zellen vor der Analyse für 16 h mit Interferonen stimuliert werden (telefonische Rücksprache mit dem Labor zwingend erforderlich).

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Zytomorphologie

Die Zytomorphologie stellt die Basis für Diagnose und Differenzialdiagnosen bzw. Ausschluss hämatologischer maligner und nichtmaligner Systemerkrankungen dar. Sie wird zur Sicherung der Diagnose, zur Klassifikation von Leukämien und Lymphomen und zur Verlaufskontrolle bzw. Remissionsbeurteilung eingesetzt. Zytomorphologische Untersuchungen von Blut- und Knochenmarkausstrichen, Körperhöhlenerguss- und Liquorzytozentrifugenpräparaten erfolgen nach Pappenheim-Färbung mittels Hellfeld-Lichtmikroskopie. Eine Einschätzung der Milzfunktion kann mit Bestimmung der sog. „pitted“ Erythrozyten erfolgen.

Analysen Zytomorphologie

  • Zur Abklärung von vermuteten Blutbildungsstörungen im Rahmen einer malignen oder nicht malignen Erkrankung. Zum Nachweis einer Infiltration des Knochenmarks durch einen Tumor oder eine hämatologische Systemerkrankung. Zur weiteren Abklärung reaktiver Prozesse.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Indiziert bei auffälligen Befunden des maschinellen Blutbildes zur Diagnostik von malignen und nicht-malignen hämatologischen Erkrankungen oder reaktiven Blutbild-Veränderungen.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Aus Aszites, Pleura- oder Pericardergüssen wird zunächst die Zellzahl bestimmt (nur für UKE-Patienten). Zytozentrifugenpräparate (oder bei sehr hoher Zellzahl Ausstriche) werden die Zellen zytologisch beurteilt. Dies dient zur Differenzialdiagnostik der Ergüsse: Unterscheidung maligne, nicht-maligne / entzündlich; Differenzierung von Lymphomen.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Im Liquor erfolgt zunächst die Zellzahlbestimmung. Alle externen Einsender werden gebeten die gemessene Zellzahl bei Einsendung von Liquorzytozentrifugationspräparaten auf dem Anforderungsschein anzugeben. Bei erhöhter Zellzahl oder gezielter Fragestellung (initiales Staging bei Leukämien und Lymphomen oder bei Rezidiverdacht) werden Zytozentrifugenpräparate zytologisch beurteilt. Dies dient zur Differenzialdiagnostik (Unterscheidung maligne, nicht-maligne / entzündlich; Differenzierung von Leukämien/Lymphomen) und bei bekannten Leukämien/Lymphomen zur initialen Bestimmung des ZNS-Status bzw. zur Remissionskontrolle.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Als „pitted“ Erythrozyten bezeichnet man Erythrozyten mit kleinen Grübchen (sogenannten „Pits“) in der Zellmembran. Diese Strukturen entstehen durch Reste von Zellmaterial oder Einschlüsse. Normalerweise werden diese Erythrozyten in der Milz entfernt. Ein erhöhter Anteil der „pitted“ Erythrozyten weist auf eine eingeschränkte Filterfunktion der Milz hin. Die Analyse erfolgt durch Phasenkontrastmikroskopie.

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Molekulargenetik

Molekulargenetische Methoden zur Untersuchung von RNA und DNA werden in unserem Labor angewandt, um Erkrankungen zu diagnostizieren, um prognoserelevante genetische Veränderungen zu detektieren, zur Bestimmung der minimalen disseminierten Erkrankung (minimal disseminated disease, MDD) bei Lymphomsubgruppen und zur Messung des stratifizierungsrelevanten molekularen Therapieansprechens bei Leukämien und Lymphomen im Sinne einer minimalen Resterkrankung (minimal residual disease, MRD). Zudem werden eine Bestimmung des Spenderchimärismus nach allogener Blutstammzelltransplantion auf DNA-Ebene und unterstützende molekulare Diagnostik von Immundefekten angeboten.

CoALL

Anhand der molekularen Quantifizierung von MRD zu festgelegten Therapiezeitpunkten erfolgt die Risikostratifizierung von Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL). Molekulare MRD ist hierbei, vergleichbar zur durchflusszytometrischen MRD, einer der Hauptfaktoren zur Entscheidung ob eine Therapie intensiviert werden muss oder auch reduziert werden kann. Am initialen Leukämiematerial aus Blut, Knochenmark, selten auch Liquor, Erguss oder einer Biopsieprobe wird mittels sog. next generation sequencing (NGS) ein Screening auf patientenspezifische molekulare Marker der leukämischen Zellen durchgeführt. Hierbei werden vor allem die Loci der Immunglobulin- und T-Zellrezeptorgene aber auch ausgewählte genomische Bruchpunkte gescreent und evaluiert (IG-, TCR-Gen, Gen-Gen-Fusionen). Im Verlauf der Therapie wird zu definierten Zeitpunkten Gesamt-DNA aus Heparin-Knochenmark isoliert, welche anschließend für ein quantitatives PCR-Verfahren genutzt wird. In diesem Verfahren kann über die leukämiespezifischen molekularen Marker die Menge der residualen Leukämiezellen quantifiziert werden.

NHL

Für Patient:innen mit ALK positiven ALCL sowie andere ALK positive Tumorerkrankungen bieten wir die Bestimmung der minimal disseminierten Erkrankung (MDD) bei Erstdiagnose und Rezidivdiagnose, sowie die Untersuchung von minimaler Resterkrankung (MRD) im Therapieverlauf an. MDD und MRD stellen unabhängige Risikofaktoren bei Patienten mit ALCL dar. Sie werden zur Risikostratifizierung und zur Beurteilung des Therapieansprechens genutzt. Methodisch wird aus EDTA-Blut oder –Knochenmark gesamt-RNA isoliert und in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. ALK Fusionsgentranskripte werden mittels qualitativer und quantitativer PCR -Verfahren nachgewiesen. NPM1::ALK Fusionsgentranskripte werden auch in nativem Tumor oder Körperhöhlenergüssen gemessen, um die Diagnose eines NPM1::ALK positiven Tumors zu bestätigen

Für Patient:innen mit peripheren T-Zell Lymphomen (PTCL), sowie für Patient:innen aller NHL Entitäten, die ein Rezidiv erlitten haben, bietet das Labor im Rahmen der laufenden Studien und Register der NHL-BFM Studiengruppe MRD-Bestimmungen mittels patientenspezifischer molekularer Marker an. Hierfür werden mittels eines sog. „genomic capture high-throughput“ Sequenzierungsverfahrens patientenspezifische MRD-Marker auf DNA-Ebene aus kryokonserviertem oder FFPE-Tumormaterial zum Zeitpunkt der Erst- oder Rezidivdiagnose identifiziert. Diese Marker werden genutzt, um mittels quantitativer PCR-Verfahren residuale Tumorzellen in DNA aus Knochenmark oder Blut der Patient:innen zu untersuchen.

PSI

Therapiebegleitend wird der Spenderchimärismus nach Blutstammzelltransplantation im peripheren Blut sowie Knochenmark gesamt und auch linienspezifisch in verschiedenen Leukozyten-Subpopulationen mittels Fragmentgrößenanalyse bestimmt.

Zur Unterstützung der Diagnosestellung bei pädiatrischen immunologischen Erkrankungen (z. B. primären Immundefekten) kann u. a. ein Vβ-Spectratyping durchgeführt werden. Zum Nachweis mütterlicher (T-) Zellen im peripheren Blut von Neugeborenen mit V. a. SCID wird das maternale Engraftment mittels Fragmentgrößenanalyse bestimmt. Als Teil des nationalen HLH-Referenzzentrums wird die molekulargenetische Analyse von Patient:innen und deren Angehörigen durchgeführt. Als Forschungsbericht kann eine Analyse mütterlicher oder kindlicher mikrochimärer Zellen mittels digitaler droplet PCR erfolgen.

Analysen Molekulargenetik

  • Für eine spätere Analyse der MRD werden molekulare Marker identifiziert und charakterisiert. Für das Markerscreening wird eine panel-basierte next generation Sequenzierung der genomischen DNA durchgeführt (genomic capture high throughput screening, gc-HTS), welche Genrekombinationen von Immunglobulin und T-Zellrezeptordomänen, sowie eine Reihe von häufigen Gen-Gen-Translokationen abdeckt. Hier finden Sie eine Übersicht der analysierten Genbereiche: Immunglobulin- und T-Zellrezeptorloci: TR-α (Jα01 – Jα61 genomisch), TR-β (Dβ und Jβ genomisch), TR-γ (Jγ Region), TR-δ (Komplett V-D-J), IGH (DH – JH – Enh – Konstante µ-Region), Igκ (Jκ genomisch + Kde), Igλ (Jλ genomisch) und ausgewählte Genloci zur Identifikation von Fusionsgenen: ETV6, KMT2A, TCF3, TAL1, ABL1/2, PDGFRβ, CSF1R, EPOR, and JAK2.

    Durch die bioinformatischen Analysen Vidjil (klonale Marker) und Segemehl (Gen-Gen-Fusionen) werden die leukämiespezifischen DNA-Signaturen identifiziert und können für das Design der patientenspezifischen RQ-PCR Assays genutzt werden.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Die Quantifizierung der MRD bei akuten lymphoblastischen Leukämien (ALL) und einigen Untertypen der Lymphome (siehe NHL) basiert auf einer real-time PCR (RQ-PCR) bei der patientenspezifische Marker mittels TaqMan® Sonden-basierter PCR amplifiziert werden. Hierbei werden vor allem Bereiche der Immunglobulin- und T-Zellrezeptorgene aber auch Gen-Gen-Fusionen wie BCR::ABL1 und KMT2A-Translokationen analysiert. Die Quantifizierung erfolgt immer in Relation zu dem initialen Material vom Tag der Diagnose. Als Kontrolle wird die DNA von Leukozytenpräparaten von gesunden Blutspendern genutzt.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Qualitativer Nachweis von NPM1::ALK Fusionsgentranskripten in peripheren Blut und Knochenmark zur Bestimmung von minimal disseminierter Erkrankung (MDD) bei Diagnosestellung und MRD im Therapieverlauf bei bekanntem NPM1::ALK positiven Anaplastisch großzelligen Lymphom (ALCL) und anderen NPM1::ALK positiven Tumorerkrankungen mit Hilfe von Endpunkt-PCR und Gelelektrophorese. Voraussetzung ist ein Nachweis der NPM1::ALK-Positivität des Tumors über molekulargenetische Methoden (RT-PCR, RNA-Sequenzierung, gc-HTS) oder eine immunhistochemische Färbung von ALK im Kern und Zytoplasma der Tumorzellen.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Quantitative Bestimmung von MDD und MRD bei NPM1::ALK positiven Anaplastisch großzelligen Lymphomen (ALCL) und anderen NPM1::ALK positiven Tumorerkrankungen über eine digitale PCR. Voraussetzung ist ein Nachweis der NPM1::ALK Positivität des Tumors über molekulargenetische Methoden (RT-PCR, RNA-Sequenzierung, gc-HTS) oder eine immunhistochemische Färbung von ALK im Kern und Zytoplasma der Tumorzellen.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Quantitative Nachweis von ALK Fusionsgentranskripten in peripheren Blut und Knochenmark zur Bestimmung von MDD und MRD von ALK Fusionsgen-positiven, NPM1::ALK negativen Anaplastisch großzelligen Lymphomen (ALCL) und anderen ALK Fusionsgen positiven, NPM1::ALK negativen Tumorerkrankungen. Die Hybridisierungsprobe des quantitativen digitalen PCR Assays ist bei dieser Untersuchung im ALK Anteil des Fusionsgen lokalisiert, so dass ein Nachweis unabhängig vom ALK Fusionspartnergen möglich ist. Voraussetzung ist der Nachweis eines varianten (nicht NPM1) ALK Fusionsgens im Tumor über molekulargenetische Methoden (RT-PCR, RNA-Sequenzierung, gc-HTS) oder ein Nachweis von ALK Expression im Tumor mittels Immunhistochemie.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Qualitativer Nachweis des NPM1::ALK Fusiongentranskript in Tumorbiopsieproben oder Körperhöhlenergüssen (Aszites, Pleura-, oder Perikarderguss) mittels Reverse Transkriptase-PCR und Gelelektrophorese. Eine Quantifizierung erfolgt mittels digitaler PCR.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Bestimmung des Spenderzellanteils im peripheren Blut oder Knochenmark nach allogener Blutstammzelltransplantation über PCR und Kapillarelektrophorese (basierend auf Short Tandem Repeats (STR) oder Variable Nucleotide Repeats (VNTR)).

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  • Bei gemischtem Gesamt-Chimärismus nach allogener Blutstammzelltransplantation wird der Spenderzellanteil in Subpopulationen des peripheren Blutes oder Knochenmarks bestimmt. Die Analyse erfolgt nach Zell-Isolierung mittels magnetischer Zellsortierung (MACS) der gewünschten Subpopulation(en) über PCR und Kapillarelektrophorese (STR und VNTR basiert).

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Bei Verdacht auf einen schweren kombinierten Immundefekt (SCID, z.B. auffälliges SCID Neugeborenen Screening, positive Familienanamnese oder klinischer Verdacht z. B. bei Erythem nach Geburt) wird der Anteil mütterlicher (T-) Zellen im peripheren Blut des neugeborenen Kindes bestimmt. Die Analyse besteht aus einer Kombination aus Chimärismusanalyse und linienspezifischem Chimärismus (CD3+ T-Zellen): MACS-Isolierung der gewünschten Subpopulation(en), PCR und Kapillarelektrophorese (STR und VNTR basiert).

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Bestimmung des Anteils mütterlicher Zellen im peripheren Blut des Kindes (maternaler Mikrochimärismus) oder fetaler Zellen im peripheren Blut der Mutter (fetaler Mikrochimärismus) zur Spenderauswahl bei haploidenter Blutstammzelltransplantation. Das Markerscreening erfolgt durch Insertions/Deletions-basierte Reverse Transkriptase PCR, die Analyse über eine spezifische digitale droplet PCR.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

  • Bei Verdacht auf angeborenen Immundefekt oder nach Blutstammzelltransplantation oder persistierender Einschränkung des TCR-Repertoires (oligoklonales Repertoire), z. B. Omenn-Syndrom, DiGeorge-Syndrom, fehlende oder stark eingeschränkte Thymusfunktion, z.B. nach Herz-Operation. Mithilfe des Vβ Spectratypings wird das T-Zell-Rezeptor-(TCR)-Repertoire analysiert. Das Rearrangement des TCR durch somatische Rekombination von V (variablen), J (joining) und C (konstanten) Regionen ist ein entscheidendes Ereignis in der Entwicklung und Reifung von T-Zellen. Die Expression einer rearrangierten TCR-beta-Kette ist die Grundvoraussetzung für die Formation eines Prä-TCRs. Es wird angenommen, dass das CDR3 (complementary determining region 3)-TCR beta-Ketten-Repertoire in gesunden Erwachsenen zwischen 3 und 4 Millionen einzigartigen Sequenzen enthält. Andere schätzen 10 bis 100 Millionen einzigartige TCRs in einem gesunden Individuum. Ein eingeschränktes Repertoire äußert sich in eingeschränkter Immunität. In diesem Assay wird ein Ausschnitt von 6 der insgesamt 24 Vβ-Ketten analysiert.

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer.

  • Bei Verdacht auf eine Hämophagozytische Lymphohistiozytose (HLH). Dieser kann durch Erfüllen ausreichender klinischer HLH-Kriterien oder auffälliger Analysen der NK und/oder T-Zell-Funktion entstehen oder im Rahmen einer Familienanamnese indiziert sein. Funktionelle Analysen (z. B. Degranulationsanalysen) erfolgen im Labor für HLH-spezifische immunologische Diagnostik am CCI der Uniklinik Freiburg (siehe Anforderungsschein HLH). Wir bitten um Rücksprache mit der HLH-Studienleitung vor Einsendung der Proben.

    Molekulargenetische Analyse der mit einer HLH assoziierten Gene (Perforin (FHL 2), UNC13D (FHL 3), Syntaxin 11 (FHL 4), UNC18B (FHL 5), LYST (CHS), SH2D1A (XLP), BIRC4 (XIAP), RAB27A (Griscelli), ITK, AP3B1 (HPSII).

    Weitere Informationen zum Untersuchungsmaterial, Probenmenge und –handhabung, Versandzeiten, Untersuchungsdauer

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