Cytometrie und Sorting Core Unit

Ziel der FACS Sorting Core Unit ist es, interessierten Wissenschaftlern/-innen den Zugang zu modernsten Geräten der Durchflusszytometrie zu bieten:

  • 2 Analyzer (CantoII und LSR Fortessa
  • 2 Sorter (AriaIIIu und AriaFusion)
  • bildgebende Durchflusszytometrie am ImageStream.

Die Nutzung des FACS CantoII und des LSR Fortessa ist nach vorheriger Schulung und Anerkennung der Nutzungsbedingungen eigenverantwortlich möglich (wird auch als Dienstleistung angeboten). Die Bedienung des FACS AriaIIIu und des FACS AriaFusion erfolgt durch die Mitarbeiterinnen der Facility.

Falls Sie eine Einweisung, Unterstützung oder Beratung bei der Bedienung der Geräte benötigen, kontaktieren Sie uns gerne. Unsere Sprechzeiten sind Mo – Do 9 -11 Uhr und 13 – 14 Uhr.

Serviceleistungen

  • Zellsortierung mit dem FACS AriaIIIu oder FACS AriaFusion
  • Sortieren von ungetesteten humanen Proben und Bakterien (FACS AriaFusion)
  • Messungen mit dem FACS CantoII und LSR Fortessa
  • Am bildgebenden Durchflusszytometer Image Stream kann man hochauflösende Bilder mit quantifizierbaren Ergebnissen (angefärbte Marker) kombinieren.
  • Analyse von Vesikeln und Micro Partikeln am Image Stream
  • Bereitstellung von Auswertestationen zur selbständigen Nutzung mit folgender Software: DIVA, FlowJo, Infinicyt und Ideas Software
  • Einarbeitung und Unterstützung neuer Nutzer am CantoII und LSR Fortessa zur selbständigen Anwendung
  • Schulung von Wissenschaftlern mit langjähriger FACS-Erfahrung am FACS AriaIIIu und den FACS AriaFusion zur selbständigen Nutzung
  • Messung neuster Fluoreszenzproteine durch Anschaffung neuer Filter möglich
    Bioinformatische Evaluierung von cytometrischen Daten (Laura Glau )
  • Regelmäßige Lehrgänge zur Durchflusszytometrie in Zusammenarbeit mit den Geräteherstellern

Zellanalyse

  • FACS Canto II

    In der Core Unit ist der FACS Canto mit 3 Lasern ausgestattet. Dieser kann für Messungen mit einfachen Farbkombinationen selbstständig oder als Dienstleistung durch die Core Unit genutzt werden.

    Es ist die Bearbeitung folgender Proben möglich: S0, S1, S2. Es dürfen keine HIV positiven oder Hepatitis-B oder -C positiven Proben gemessen werden. Daher müssen primäre humane Proben vorher darauf getestet werden oder die Proben müssen fixiert werden.

    Das Gerät ist mit folgenden Lasern ausgestattet:

    • 407 nm: violetter Laser
    • 488 nm: blauer Laser
    • 633 nm: roter Laser

  • FACS LSR Fortessa

    Zur Erweiterung des Messspektrums steht der LSR Fortessa als Durchflusszytometer in der Core Unit zur Verfügung. Das Gerät bietet zusätzlich einen gelb-grünen Laser an, wodurch eine bessere Detektion bei der Verwendung von PE-Farbstoffen und roten Fluoreszenzproteinen möglich ist. Es können bis zu 17 Farbstoffe in einer Probe verwendet werden. Messungen können selbständig bzw. als Dienstleistung durch die Core Unit durchgeführt werden.

    Es ist die Bearbeitung folgender Proben möglich: S0, S1, S2. Es dürfen keine HIV positiven oder Hepatitis-B oder -C positiven Proben gemessen werden. Daher müssen primäre humane Proben vorher darauf getestet werden oder die Proben müssen fixiert werden.

    Das Gerät ist mit folgenden Lasern ausgestattet:

    • 405 nm: violetter Laser
    • 488 nm: blauer Laser
    • 561 nm: grüner Laser
    • 640 nm: roter Laser

Zellsortierung

  • 1. Die Zellen werden durch einen Hüllstrom wie Perlen an einer Schnur aufgereiht (hydrodynamische Fokussierung)

    2. Im Laserschnittpunkt findet die Analyse der Zellen statt.

    3. Die Nozzle trennt den Strahl in einzelne Tropfen und lädt die zu sortierenden Tropfen auf.

    4. Die aufgeladenen Tropfen werden im elektrischen Feld abgelenkt und fallen in das entsprechende Auffanggefäß.

  • Die folgenden Tabellen zeigen, wie lange ein Sortiervorgang dauert. Dies sind Mindestzeiten, ca. 20 min müssen für die Einstellung des Geräts zugerechnet werden. Die Dauer variiert mit der Größe der Zellen.

    Sortdauer kleiner Zellen

    Sortdauer für kleine Zellen (15000/Sek., Modus: Yield)
    Sortdauer großer Zellen

    Sortdauer für große Zellen (5000/Sek., Modus: Yield)
  • Beispiele für Farbkombinationen für eine Mehrfarbanalysen

  • Folgende Sortoptionen sind mit dem FACS AriaIIIu und FACS AriaFusion möglich:

    FACS 15 ml Tube

    1.) Auftrennung in bis zu 2 Populationen in 15 ml Röhrchen

    FACS Tubes
    FACS Reaktionsgefäße

    2.) Auftrennung in bis zu 4 Populationen in FACS-Röhrchen oder Reaktionsgefäßen mit Deckel

    96-well Sortierung

    3.) Ablage in Mikrotiterplatten (z.B. 96-Well)

  • FACS AriaIllu

    Mit diesem Zytometer können eine oder mehrere Zellpopulationen aus der Suspension heraussortiert werden (Achtung: nicht alle Zellen lassen sich gut sortieren, mitunter sind die Populationen sehr empfindlich). Die sortierten Zellen können weiter kultiviert werden.
    Das Cell Sorting am FACS AriaIIIu wird von Mitarbeiterinnen der Core Unit übernommen. Das Gerät ist mit folgenden Lasern ausgestattet:

    • 407 nm: violetter Laser
    • 488 nm: blauer Laser
    • 561 nm: grüner Laser
    • 633 nm: roter Laser

  • Mehrfarbenkombination
    Lupe zum Vergrößern des Bildes
    Beispiele für Farbkombinationen bei einer Mehrfarbenanalyse.

    Das Gerät ist mit folgenden Lasern ausgestattet:

    • 355 nm: UV Laser
    • 405 nm: violetter Laser
    • 488 nm: blauer Laser
    • 561 nm: grüner Laser
    • 640 nm: roter Laser

Weitere Ausstattung

  • Technische Informationen:

    Laser:
    - 488 nm blue laser (high-power)
    - 642 nm red laser
    - 785 nm far red laser
    - 375 nm UV laser
    - 405 nm violet laser
    - 561 nm green laser

    Geschwindigkeit:
    - bis zu 200 events pro Sekunde

    Objektive
    -20x, 40x und 60x Vergrößerung

    Probencharakteristika:
    - Volumen: 20-200yl
    - Utilization efficiency: bis zu 95%

Anmeldung

Die Cytometrie und Sorting Core Unit steht allen Forschern/-innen am UKE und Interessierten zur Nutzung offen. Die Buchung erfolgt über das bereitgestellte Internetbuchungssystem. Neue Nutzer wenden sich bitte direkt an die angegebenen Kontaktpersonen.
Es fällt eine Nutzungspauschale per Nutzungsstunde an, die auf Grundlage der benötigten Verbrauchsmittel berechnet wurde.
Die Nutzungspauschale beträgt (Stand Oktober 2018):

  • FACS CantoII: 17 € pro Stunde
  • FACS LSR Fortessa 22 € pro Stunde
  • FACS AriaIII 60 € pro Stunde
  • FACS AriaFusion 60 € pro Stunde
Es wird vierteljährlich die Gesamtnutzungszeit für jeden Nutzer ermittelt und auf volle Stundenzahl abgerundet. Beachten Sie bitte die Nutzungsordnungen für die einzelnen Geräte.

Bioinformatische Analysen

Analyse Bioinformatik1
Analyse Bioinformatik1

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Analyse 1

Analyse 1
  • Analysemöglichkeit 1

    Erstellung von t-SNE Plots und Heatmaps aus Daten, die durch das klassische manuelle Gating in FlowJo oder FACSDiva generiert wurden

    Nachdem die Proben am FACS aufgenommen und die Zellpopulationen von Interesse manuell in FlowJo oder Diva gegated wurden, erhält man eine (meist große) Excel-Tabelle, die alle Proben und alle Zellpopulationen enthält. Aus dieser Tabelle t-SNE Plots und Heatmaps zu erstellen, erzeugt eine Übersicht über die Daten und zeigt Untergruppen von Proben mit einem ähnlichen Immunphänotyp. In dieser Analyse können auch klinische Parameter und Metadaten der Proben inkludiert werden.

  • Bioinformatiksche Analyse 2

    Nach der Aufnahme der Daten, perfekter Kompensation und Entfernen von Trash und unerwünschten Zellpopulationen aus der FCS-Datei, erstellt diese Analyse t-SNE Plots direkt aus den FCS-Dateien. Die Plots werden nach der Expression aller im Panel enthaltenen Marker und nach der Zelldichte eingefärbt, was in einem Einzelzell-Überblick über alle bereits bekannten Populationen sowie über möglicherweise bisher nicht betrachtete Populationen resultiert. Es besteht die Möglichkeit t-SNE Plots für den visuellen Vergleich zwischen verschiedenen Proben oder Gruppen von Proben zu erzeugen.

  • Bioinformatische Analyse 3

    Wie auch für Analyse (2) müssen die Daten für diese Analyse perfekt kompensiert sein und Trash und unerwünschte Zellpopulationen müssen aus den FCS-Dateien entfernt sein. Diese Analyse teilt die Zellen automatisiert in Cluster mit unterschiedlichen Phänotypen ein (vergleichbar dazu, was in einem manuellen Gating gemacht wird) und erstellt aus diesen Clustern einen SPADE-Baum. Diese Bäume können weiter analysiert werden, um beispielsweise Gruppen von Proben miteinander zu vergleichen und signifikant unterschiedliche Cluster in den Gruppen zu finden.

    Für diese Analyse ist die Qualität der Daten besonders essentiell, daher wird empfohlen schon vor Beginn des Experimentes Kontakt mit uns aufzunehmen und das Experiment so zu planen, dass die Daten für diese Analyse geeignet sind.

  • Logo SFB 1192

    Ansprechpartnerin

    Laura Glau

    Tel.: 7410-51979, Raum 04.054

    Email: l.glau@uke.de

Kontakt

Standort:

N27 (Campus Forschung)
4. Etage Raum 61.1

Melanie Lachmann
Melanie Lachmann
  • Stellvertretende Leitung
  • FACS Sorting Core Unit

Kontakt Bioinformatische Analysen