FACS Sorting Core Unit

Ziel der FACS Sorting Core Unit ist es, interessierten Wissenschaftlern/-innen den Zugang zu modernsten Geräten der Durchflusszytometrie zu bieten und sie mit wissenschaftlicher Expertise bei ihren jeweiligen Fragestellungen zu unterstützen. Angesiedelt in der Interdiziplinären Klinik für Stammzelltransplantation stehen in der Unit hierzu fünf hochwertige Geräte zur Analyse (FACS CantoII und FACS LSR Fortessa) bzw. zur Sortierung (FACS AriaIIIu und FACS AriaFusion) sowie ein Imaging Flow Cytometer zur Verfügung.
Die Nutzung des FACS CantoII und des LSR Fortessa ist nach vorheriger Schulung und Anerkennung der Guidelines eigenverantwortlich möglich. Die Bedienung des FACS AriaIIIu und des FACS AriaFusion erfolgt durch die Mitarbeiterinnen der Facility. Falls Sie Expertenunterstützung und -beratung benötigen, kann diese gerne bei verfügbarer Kapazität erteilt werden. Bitte wenden Sie sich in diesem Fall mit Ihrer Anfrage per mail an die FACS Sorting Core Unit: facs(at)uke.de.

Serviceleistungen

  • Zellsortierung mit dem FACS AriaIIIu oder FACS AriaFusion
  • FACS Messungen mit dem FACS CantoII und LSR Fortessa
  • methodische (Probenbearbeitung, Applikationen) und technische Beratung
  • Unterstützung bei der Etablierung neuer Applikationen, z.B.
    • Multicolor-Analyse
    • Oberflächenmarker
    • Intrazelluläre Marker
    • Fluoreszenz-Proteine
    • Funktionelle und Immunoassays
    • Apoptose
    • Zytokinbestimmung
    • Zellzyklusanalyse
    • Side Population
  • Schulung neuer Mitarbeiter am FACS CantoII und LSR Fortessa für Mitarbeiter mit langjähriger FACS-Erfahrung auch am FACS AriaIIIu und FACS AriaFusion
  • Bioinformatische Unterstützung

Zellanalyse

  • FACS Canto II

    Mit dem FACS Canto II können FACS Messungen selbständig bzw. durch die Core Facility Mitarbeiterinnen durchgeführt werden. Das Gerät ist mit folgenden Lasern ausgestattet:

    • 407 nm: violetter Laser
    • 488 nm: blauer Laser
    • 633 nm: roter Laser

  • FACS LSR Fortessa

    Der LSR Fortessa erweitert als neues Durchflusszytometer die FACS Sorting Core Unit. Das Gerät bietet zusätzlich zu dem blauen, violetten und roten Laser einen gelb-grünen Laser zur besseren Detektion bei der Verwendung von PE-Farbstoffen und roten Fluoreszenzproteinen. Es können bis zu 17 Farbstoffe in einer Probe verwendet werden.
    Mit dem FACS LSR Fortessa können FACS Messungen selbständig bzw. durch die Core Facility Mitarbeiterinnen durchgeführt werden. Das Gerät ist mit folgenden Lasern ausgestattet:

    • 405 nm: violetter Laser
    • 488 nm: blauer Laser
    • 561 nm: grüner Laser
    • 640 nm: roter Laser

Zellsortierung

  • 1. Die Zellen werden durch einen Hüllstrom wie Perlen an einer Schnur aufgereiht (hydrodynamische Fokussierung)

    2. Im Laserschnittpunkt findet die Analyse der Zellen statt.

    3. Die Nozzle trennt den Strahl in einzelne Tropfen und lädt die zu sortierenden Tropfen auf.

    4. Die aufgeladenen Tropfen werden im elektrischen Feld abgelenkt und fallen in das entsprechende Auffanggefäß.

  • Die folgenden Tabellen zeigen, wie lange ein Sortiervorgang dauert. Dies sind Mindestzeiten, ca. 20 min müssen für die Einstellung des Geräts zugerechnet werden. Die Dauer variiert mit der Größe der Zellen.

    Sortdauer kleiner Zellen

    Sortdauer für kleine Zellen (15000/Sek., Modus: Yield)
    Sortdauer großer Zellen

    Sortdauer für große Zellen (5000/Sek., Modus: Yield)
  • Beispiele für Farbkombinationen für eine Mehrfarbanalysen

  • Folgende Sortoptionen sind mit dem FACS AriaIIIu und FACS AriaFusion möglich:

    FACS 15 ml Tube

    1.) Auftrennung in bis zu 2 Populationen in 15 ml Röhrchen

    FACS Tubes
    FACS Reaktionsgefäße

    2.) Auftrennung in bis zu 4 Populationen in FACS-Röhrchen oder Reaktionsgefäßen mit Deckel

    96-well Sortierung

    3.) Ablage in Mikrotiterplatten (z.B. 96-Well)

  • FACS AriaIllu

    Mit diesem Zytometer können eine oder mehrere Zellpopulationen aus der Suspension heraussortiert werden (Achtung: nicht alle Zellen lassen sich gut sortieren, mitunter sind die Populationen sehr empfindlich). Die sortierten Zellen können weiter kultiviert werden.
    Das Cell Sorting am FACS AriaIIIu wird von Mitarbeiterinnen der Core Unit übernommen. Das Gerät ist mit folgenden Lasern ausgestattet:

    • 407 nm: violetter Laser
    • 488 nm: blauer Laser
    • 561 nm: grüner Laser
    • 633 nm: roter Laser

  • Mehrfarbenkombination
    Lupe zum Vergrößern des Bildes
    Beispiele für Farbkombinationen bei einer Mehrfarbenanalyse.

    Das Gerät ist mit folgenden Lasern ausgestattet:

    • 355 nm: UV Laser
    • 405 nm: violetter Laser
    • 488 nm: blauer Laser
    • 561 nm: grüner Laser
    • 640 nm: roter Laser

Weitere Ausstattung

  • Technische Informationen:

    Laser:
    - 488 nm blue laser (high-power)
    - 642 nm red laser
    - 785 nm far red laser
    - 375 nm UV laser
    - 405 nm violet laser
    - 561 nm green laser

    Geschwindigkeit:
    - bis zu 200 events pro Sekunde

    Objektive
    -20x, 40x und 60x Vergrößerung

    Probencharakteristika:
    - Volumen: 20-200yl
    - Utilization efficiency: bis zu 95%

Anmeldung

Die FACS Sorting Core Unit steht allen Forschern/-innen am UKE und Interessierten zur Nutzung offen. Die Buchung erfolgt über das bereitgestellte Internetbuchungssystem. Neue Nutzer wenden sich bitte direkt an die angegebenen Kontaktpersonen.
Es fällt eine Nutzungspauschale per Nutzungsstunde an, die auf Grundlage der benötigten Verbrauchsmittel berechnet wurde.
Die Nutzungspauschale beträgt (Stand Oktober 2018):

  • FACS CantoII: 17 € pro Stunde
  • FACS LSR Fortessa 22 € pro Stunde
  • FACS AriaIII 60 € pro Stunde
  • FACS AriaFusion 60 € pro Stunde
Es wird vierteljährlich die Gesamtnutzungszeit für jeden Nutzer ermittelt und auf volle Stundenzahl abgerundet. Beachten Sie bitte die Nutzungsordnungen für die einzelnen Geräte.

Bioinformatische Analysen

  • Analysemöglichkeit 1

    Erstellung von t-SNE Plots und Heatmaps aus Daten, die durch das klassische manuelle Gating in FlowJo oder FACSDiva generiert wurden

    Nachdem die Proben am FACS aufgenommen und die Zellpopulationen von Interesse manuell in FlowJo oder Diva gegated wurden, erhält man eine (meist große) Excel-Tabelle, die alle Proben und alle Zellpopulationen enthält. Aus dieser Tabelle t-SNE Plots und Heatmaps zu erstellen, erzeugt eine Übersicht über die Daten und zeigt Untergruppen von Proben mit einem ähnlichen Immunphänotyp. In dieser Analyse können auch klinische Parameter und Metadaten der Proben inkludiert werden.

  • Bioinformatiksche Analyse 2

    Nach der Aufnahme der Daten, perfekter Kompensation und Entfernen von Trash und unerwünschten Zellpopulationen aus der FCS-Datei, erstellt diese Analyse t-SNE Plots direkt aus den FCS-Dateien. Die Plots werden nach der Expression aller im Panel enthaltenen Marker und nach der Zelldichte eingefärbt, was in einem Einzelzell-Überblick über alle bereits bekannten Populationen sowie über möglicherweise bisher nicht betrachtete Populationen resultiert. Es besteht die Möglichkeit t-SNE Plots für den visuellen Vergleich zwischen verschiedenen Proben oder Gruppen von Proben zu erzeugen.

  • Bioinformatische Analyse 3

    Wie auch für Analyse (2) müssen die Daten für diese Analyse perfekt kompensiert sein und Trash und unerwünschte Zellpopulationen müssen aus den FCS-Dateien entfernt sein. Diese Analyse teilt die Zellen automatisiert in Cluster mit unterschiedlichen Phänotypen ein (vergleichbar dazu, was in einem manuellen Gating gemacht wird) und erstellt aus diesen Clustern einen SPADE-Baum. Diese Bäume können weiter analysiert werden, um beispielsweise Gruppen von Proben miteinander zu vergleichen und signifikant unterschiedliche Cluster in den Gruppen zu finden.

    Für diese Analyse ist die Qualität der Daten besonders essentiell, daher wird empfohlen schon vor Beginn des Experimentes Kontakt mit uns aufzunehmen und das Experiment so zu planen, dass die Daten für diese Analyse geeignet sind.

  • Logo SFB 1192

    Ansprechpartnerin

    Laura Glau

    Tel.: 7410-51979, Raum 04.054

    Email: l.glau@uke.de

Kontakt

Standort:

N27 (Campus Forschung)
4. Etage Raum 61.1

Melanie Lachmann
Melanie Lachmann
  • Stellvertretende Leitung
  • FACS Sorting Core Unit

Kontakt Bioinformatische Analysen