Methoden
Lectin-based glycomics
Lektin-basierte Glycomics: Diese Technik nutzt ein Panel von Lektinen, einer Gruppe von Biomolekülen, die in der Lage sind, den "Glykocode" zu entschlüsseln, in Form eines Lektin-Mikroarrays. Die Methode ermöglicht die Analyse mehrerer Glykan-Lektin-Interaktionen, so dass ein differenziertes Glykanprofil schnell und sensitiv bestimmt werden kann.
Dieser Ansatz steht in deutlichem Gegensatz zur Massenspektrometrischen Analyse, die eine vorherige Freisetzung der Glykane erfordert. Bei Glyko-HAM verfügen wir über Lectin-basierte Western Blot, Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie. Obwohl der Lektin-Microarray keine eindeutigen Strukturen von Glykanen und ihren Bindungsstellen liefern kann, gibt er nützliche Hinweise auf die charakteristischen Merkmale von Glycokonjugaten. Dazu gehören nicht nur Unterschiede in den terminalen Modifikationen (z. B. Sialinsäurebindung, Fucosylierungs-typen), sondern auch in den höher geordneten Strukturen bezüglich der Glykandichte, -tiefe und -richtung, die sowohl für N- als auch für O-Glykane gelten. Je nach Projektanforderungen können wir mit der Lektin-basierten Glykoanalyse Glycane in Gewebeschnitten, Primärzellen und Bulkgewebe untersuchen.
IgG Glycosylation
IgG-Glykosylierungsanalyse: Die Glykosylierung ist eine der häufigsten posttranslationalen Modifikationen von Antikörpern. Die an die Proteine gebundenen Glykane können die Proteinstabilität, Bioaktivität und Immunogenität direkt beeinflussen. Bei Glyco-HAM bieten wir eine Analyse von IgG-spezifischen Glykosylierungsmerkmalen an, darunter:
- Fc-Glykosylierung
- Glykanstruktur: die Struktur der Kohlenhydratketten, das Oligosaccharidmuster (Antennenprofil)
- Abundanz: der Kohlenhydratgehalt (Neutralzucker, Aminozucker und Sialinsäuren)
MALDI-Imaging- Massenspektrometrie
MALDI-MS-Imaging (MALDI-MSI) ist eine Methode, mit der die Verteilung von Molekülen in einem Gewebeschnitt untersucht werden kann. Dabei wird ein Gewebeschnitt auf einem Objektträger mit einer MALDI-Matrix beschichtet. Im Anschluss wird das Gewebe in x-/y-Richtung mit dem MALDI-Laser abgerastert und je Messpunkt ein Spektrum aufgenommen. Mit den erhaltenen Daten kann Intensität eines definierten m/z-Verhältnisses zweidimensional für den Gewebeschnitt angezeigt werden. Ziel dieser Untersuchungen ist es, gewebe- oder krankheitsspezifische Marker zu finden,
um diese anschließend weiter zu untersuchen.
Geeignete Molekülklassen sind tryptische Peptide, Lipide und N-Glykane.
LC-MS glycomics
Flüssigkeitchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie LC-MS(/MS) ist eine leistungsstarke Technik zur Trennung und Identifizierung zur Analyse von Molekülen in einer komplexen Probe. Je nach Probenvorbereitung und chromatographischen Trennprinzipien kann die LC-MS-basierte Glykomik zur Identifizierung von Glykanen oder Glykopeptiden eingesetzt werden.
Glykopeptide können sowohl Aufschluss über die Struktur als auch über die Aminosäureposition des Glykans geben. Da Glykopeptide hydrophober sind als Glykane, weisen sie in der Regel eine gute Affinität zu klassischen RP-C18-Säulen auf. Um sowohl die Glykanstruktur als auch die Sequenz des Glykopeptids zu identifizieren, können hochentwickelte Fragmentierungsmethoden wie ETD/HCD eingesetzt werden.
Die chromatographische Trennung von Glykanen ist aufgrund ihrer hydrophilen Eigenschaften eine Herausforderung. Um ihre Bindung an RP-C18-Säulen zu verbessern, permethylieren wir Glykane, wodurch sie hydrophober werden. Danach ist die Messung auf RP-C18-Säulen möglich, aber die Identifizierung bleibt schwierig.
Laser ablation
Die Probengewinnung erfolgt per Infrarotlaserablation.
Zur schonenden und gezielten Ablation von Geweben setzen wir einen Nanosekunden-Infrarotlaser (NIRL) ein. Die ultrakurzen Pulse des Lasers erlauben eine schonende Ablation und rückstandslose Homogenisierung des Gewebes, wobei die untersuchten Biomoleküle intakt bleiben. (DOI: 10.1002/anie.201407669; DOI: 10.3390/ijms24097820). Der Laserstrahl kann dabei sehr genau in x,y,z-Richtung gesteuert werden, sodass beispielsweise die schichtweise Abtragung des murinen Darms sowie die anschließende Proteomanalytik der Schichten gelang (DOI: 10.3390/ijms23116132). Es konnte gezeigt werden, dass posttranslationale Modifikationen an Proteinen intakt bleiben, sodass sich die Methode optimal für die Gewinnung von Proben für die anschließende Analytik von Glykoproteinen eignet (DOI: 10.1016/j.jprot.2015.12.029).
Bioinformatic
Die MS-basierte Analyse von Glykanen, Glykopeptiden und MS-Imaging-Daten ist aufgrund der großen Datenmenge und der unterschiedlichen Strukturen von Glykanen und Glykopeptiden eine Herausforderung. Daher ist eine bioinformatische Verarbeitung erforderlich, um Strukturen, Markerkandidaten und signifikante Unterschiede zwischen Proben zu identifizieren. Die Software-Tools für permethylierte Glykane und Glykopeptide sind in ihrem Entwicklungsstadium noch nicht vergleichbar mit denen zur Analytik anderer Omics-Daten wie bspw. Proteomdaten. Insbesondere permethylierte Glykane werden häufig noch händisch, mit Unterstützung von Softwaretools wie GlykoWorkbench ausgewertet. Für Glykopeptide nutzen wir unter anderem GlycoPat und PGlyco. Zur Auswertung von MS-Imaging-Daten arbeiten wir mit der Software SCiLS Lab.
