Methoden

Methodenspektrum

  • Die im Rahmen der Forschungsprojekte untersuchten Wechselwirkungen von Blutzellen und Tumorzellen mit dem Endothel finden im Blutstrom des menschlichen Körpers überwiegend in den kleinen Gefäßen statt. Diese haben einen Durchmesser im Mikrometerbereich (10-6 m). Da sich die physikalischen Bedingungen unter Fluss auf dieser Mikroebene deutlich von denen uns vertrauten makroskopischen unterscheiden (Stichwort: Reynolds Zahl), ist es notwendig, zur Nachstellung eines „künstlichen“ Gefäßes Flusskammersysteme zu verwenden, die in ihrer Größenordnung dem simulierten Gefäß entsprechen.
    Hierzu verwenden wir eine Reihe maßstabsgerechter Flusskammern, in denen wir die Strömungsverhältnisse durch die Verwendung verschiedener „Antriebssyteme“ präzise kontrollieren können. Zur Anwendung kommen neben der klassischen Spritzenpumpe luftdruckgetriebene Pumpen zur kontinuierlichen Überströmung über Tage (System „ibidi“) und zur Verwendung kleiner Volumina (System „Bioflux“).
    Den Systemen gemeinsam ist, dass sie die für die jeweilige Fragestellung vorherrschenden Umgebungsbedingungen simulieren, Funktionalisierung der Oberflächen oder Kultivierung von Endothelzellen ermöglichen und während der Experimente direkt mikroskopischen und molekularbiologischen Untersuchungen zugänglich sind.

    Pneumatisch getriebenes Mikrofluidiksystem Bioflux
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    Mit einer Kanalhöhe von lediglich 70 µm und einer Breite von 320 µm eignet sich dieses Sys-tem für die standardisierte Testung kleiner Volumina unter Fluss auf
  • Die Intravitaltomographie ist ein bildgebendes System, welches auf dem Prinzip der Multiphotonen-Laser-Tomographie basiert. Diese ist, ähnlich wie die bekannte Ultraschalluntersuchung, eine nicht-invasive und klinisch zugelassene Untersuchungsmethode. Bei der Multiphotonentomographie wird gepulstes Licht im nahen Infrarotbereich, erzeugt von einem Titan:Saphir Laser, benutzt, um in der zu untersuchenden Haut des Patienten den natürlichen Effekt der Autofluoreszenz hervorzurufen. Diese Autofluoreszenz wird in Bezug auf Intensität und präzise räumliche Zuordnung detektiert und zur Darstellung hochauflösender Bilder verwendet. Studien zur Sicherheit der Methodik haben ergeben, dass diese Technik an menschlicher Haut ohne Gefahren anwendbar ist.
    Das in unserer Studie zur Anwendung kommende Verfahren unterscheidet sich von der alleinigen Multiphotonentomographie dadurch, dass es durch den Einsatz weiterer Detektionsinstrumente möglich wird, die exakte Zeit zu messen, die ein Molekül in der menschlichen Haut nach Anregung leuchtet (Fluorescence lifetime imaging, FLIM). Diese Fluoreszenzabklingzeit wird für jeden aufgenommenen Bildpunkt mit einer Genauigkeit im Picosekundenberich (10-12 Sekunden) berechnet und schafft einen direkten Einblick in den molekularen Aufbau und den aktuellen Energiezustand der untersuchten Zellen. Im Rahmen der aktuellen Studie ermöglicht die Messung der spezifischen Autofluoreszenzen und deren Abklingzeiten die Charakterisierung und Diagnostik entzündlich veränderter Haut und eröffnet einen direkten Einblick in die Physiologie der Wundheilung.

    Intravitales FLIM der Haut eines gesunden Probanden
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    Die Darstellung der Fluoreszenzabklingzeiten mittels Multiphotonentomographie wird farbkodiert der Morphologie überlagert. Bei Anregung des autofluoreszierende
  • Die Reflexions-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie ist ein lichtoptisches Verfahren, bei dem die Probe mit polarisiertem Licht bestrahlt wird. Das Licht wird an Grenzflächen mit unterschiedlichen Brechungsindizes reflektiert; dazu zählt zum einen die Oberflächenebene (Deckglas) als auch darauf oder knapp darüber befindliche Teilchen. Lediglich dieser reflektierte Anteil trägt zur Bildgebung bei. Da sich der Abstand zur Oberflächenebene in einer längeren Laufzeit dieser Photonen widerspiegelt, entsteht durch Überlagerung der Photonen, die unterschiedliche Wegstrecken zurückgelegt haben, ein kontrastreiches Interferenzbild.
    Aus diesem Grunde können Zellen oder Thrombozyten, die in direkten Kontakt mit der in unserem System verwendeten funktionalisierten Oberflächenebene treten, dort adhärieren oder migrieren, kontrastreich und färbefrei aufgelöst werden. Somit eröffnet diese Mikroskopietechnik die Möglichkeit, auch undurchsichtige Flüssigkeiten wie z.B. Patientenblut, ohne weitere Vorbehandlung in unseren Flusskammersystemen zu verwenden und die Vorgänge an der Wand des Kammersystems direkt zu beobachten.

  • Das Rasterkraftmikroskop (atomic force microscopy, AFM) ist, ähnlich wie das Elektronenmikroskop, ein hochauflösendes Mikroskop, welches die Untersuchung der Oberflächentopographie im Subnanometerbereich ermöglicht. Da im Gegensatz zur Elektronenmikroskopie keine Probenpräparation nötig ist, können biologische Strukturen nativ oder sogar in vivo untersucht werde. Das AFM findet deshalb in zwei der Forschungsschwerpunkte seine Anwendung:

    1. Nano-Analyse des Stratum corneums

    2. Tool für die Zellbiologie

    Darstellung eines einzelnen Korneozyten
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    Darstellung eines einzelnen Korneozyten, isoliert aus dem Stratum corneum eines gesunden Probanden
    AFM Untersuchung von Endothelzellen, vertical deflection image
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    A: Nicht stimulierte Endothelzellen weisen eine glatte Zelloberfläche auf. B: Die Oberflächenstruktur stimulierten Endothels imponiert rau, hervorgerufen durch
  • Die Malignität von Tumorzellen korreliert mit ihrer Fähigkeit innerhalb des gesunden Gewebes zu wachsen, zu migrieren und sich über das vaskuläre oder lymphatische Gefäßsystem systemisch auszubreiten. Voraussetzung für die Invasion, Extravasation und Bildung von Metastasen ist die Sekretion von hydrolytischen Enzymen, die die Extrazelluläre Matrix (ECM) innerhalb des betroffenen Zellverbands degradieren können und so den Weg für die wandernde Tumorzelle ebnen. Neben verschieden ECM modifizierenden Enzymen spielen besonders die Matrix-Metalloproteasen (MMPs) eine entscheidende Rolle im Verlauf der Tumorzellmigration.
    In dem von uns etablierten Invasionsassay stellt ein aus Epithelzellen gebildeter Zellrasen, charakterisiert durch einen hohen elektrischen Widerstand (12.000 Ω * cm²), eine Barriere gegenüber der migrierenden Tumorzelle dar. Ist die Tumorzelle durch die Sekretion proinvasiver Moleküle in der Lage, den Epithelzellrasen zu permeabilisieren, kommt es zu einem Widerstandseinbruch. Die hohe Sensitivität des Versuchsaufbaus erlaubt die Vermessung des Zell-Widerstands im zeitlichen Verlauf und ermöglicht so, schon bei einer sehr geringen, mikroskopisch nicht fassbaren Schädigung des Epithelzellrasens eine exakte Quantifizierung des Metastasierungspotentials.
    Durch den Einsatz dieses hoch sensitiven Messverfahrens konnte die Rolle von MMPs für die Zellinvasion verschiedener Melanomzelllinien bestimmt werden. Gegenwärtig nutzen wir den Invasionsassay zur Charakterisierung der Urothelzellkarzinomprogression bezüglich der grundlegenden molekularen Mechanismen.

  • Das hier formulierte Teilprojekt beschäftigt sich mit der Rolle des Gerinnungssystems, das neben der Entstehung von Thrombosen, möglicherweise auch entscheidenden Einfluss auf die Tumorprogression des malignen Melanoms und anderer Tumore nimmt. Aus unserem in vitro Modell „Tumor-Endothel-Interaktion“ resultiert die Hypothese, dass eine von Thrombozyten umgebene Tumorzelle das Gerinnungssystem nutzt, um am Endothel zu adhärieren und in das Gewebe auszuwandern (Extravasation). Durch Experimente an verschiedenen Mausmodellen validieren wir in vitro Befunde am lebenden Organismus. Definierte Tumore mit Metastasen in Lunge oder Lymphknoten werden über intravenöse oder intradermale Injektion der Tumorzellen induziert. Um die Situation der Tumormetastasierung im Patienten besser nachzustellen, verwenden wir ebenfalls das ret transgene Spontanmelanom-Mausmodell. Weiterhin haben wir durch den Einbezug von VWF- und ADAMTS13-knockout Mauslinien einen besonderen Zugang zu einer gezielten Funktionsaufklärung von VWF bei der Tumorausbreitung. Neben der Aufklärung grundlegender Mechanismen der Metastasierung und der Tumorprogression nutzen wir diese Mausmodelle auch zur Evaluation neuer Therapien. Ein Beispiel ist die Nutzung niedermolekularer Heparine, welche durch eine Blockade des Gerinnungssystems einer Metastasierung entgegenwirken können.