Mitarbeiter Arbeitsgruppe molekulare Immunologie 

(Prof. Dr. med. Friedrich Nolte, Nicole Schwarz,  Fabienne Seyfried,  Janusz Wesolowski, Marion Nissen,  Sophie Huggett, Björn Rissiek, Mandy Unger, Welbeck Danquah)

Forschungsprojekte

Die Arbeitsgruppe molekulare Immunologie untersucht Funktionen und Fehlfunktionen von T-Zellen und deren Bedeutung für die Pathogenese von Autoimmunerkrankungen und für die Wirt-Pathogen Interaktion. Im Zentrum unseres Interesses liegt die molekulare Charakterisierung von funktionell revelanten T-Zell Membranproteinen. Dabei haben wir eine vielversprechende Familie regulatorischer Enzyme, sog. ADP-Ribosyltransferasen (ARTs) entdeckt (Koch-Nolte et al., 1996 a, b, 2001). ARTs steuern die Funktion anderer Proteine durch Anheften einer kleinen chemischen Gruppe - ADP-Ribose (s. Abb. 1).

^{Abb. 1. ARTs transferieren die ADP-Ribose Gruppe (rot) von NAD auf Zielproteine, während Nikotinamid (türkis) freigesetzt wird. Die ADP-Ribosylierung führt meist zur Inaktivieurng des Zielproteins.}

Die ADP-Ribosylierung von Proteinen kann durch Verwendung von radioaktiv markiertem NAD verfolgt werden (s. Abb. 1), da das radioaktive Phosphor (32P) als Teil von ADP-Ribose in das Zielprotein miteingebaut wird. Kürzlich haben wir nichtradioaktive Assays zum Nachweis von ADP-ribosylierten Proteinen entwickelt (Abb. 2). Dabei wird etheno-NAD anstelle von NAD als Substrat eingesetzt. Etheno-ADP-ribosylierte Proteine können dann mit einem etheno-Adenosin spezifischen Antikörper nachgewiesen und aufgereinigt werden (Krebs et al., 2003).

^{Abb. 2 ARTs können auch etheno-NAD als Substrat verwenden, das sich von NAD nur durch eine zusätzliche Ring-struktur (grün) unterscheidet. Diese Struktur wird durch den monoklonalen Antikörper 1G4 spezifisch erkannt. Die Bindung von 1G4 seinerseits kann durch Fluorochrom- Enzym- oder Matrix-gekoppelte Sekundärantikörper dargestellt werden.}

Cholera und Keuchhusten sind Beispiele für Krankheiten, die durch von Bakerien sezernierte ARTs verursacht werden. Diese ADP-ribosylierenden Toxine dringen in humane Wirtszellen ein, wo sie durch Anheften der ADP-Ribose Gruppe Schlüsselproteine des zellulären Stoffwechsels inaktivieren (s. Abb. 3) (In Zusammenarbeit mit der AG Rhen, Karolinska Institut, Stockholm ). Unsere Arbeitsgruppe erbrachte den Nachweis, dass auch die Virulenz von Salmonellen durch eine ADP-Ribosyltransferase bestimmt wird, die Aktin, eine wichtige Komponente des zellulären Zytoskeletts, ADP-ribosyliert und damit inaktiviert (Otto et al., 2000).

^{Abb. 3. Cholera- und Pertussistoxine ADP-ribosylieren heterotrimere G-Proteine in humanen Wirtszellen. Die dadurch bedingte Beeinträchtigung der Signaltransduktion führt zu Durchfällen und Keuchhusten.}

Wir haben eine Familie endogener ARTs bei Maus und Mensch identifiziert und molekular kloniert (Glowacki et al., 2002). Zu ihren Zielproteinen gehören u.a. wichtige T-Zellmembran-Proteine (CD8, CD44, CD45, LFA1) und sezernierte antibakterielle Proteine (Defensin, Tuftsin). Die kürzlich von uns in Zusammenarbeit mit der AG Schulz, Universität Freiburg, entschlüsselte 3D-Struktur des ART2 der Ratte belegt eindrucksvoll die enge strukturelle Verwandschaft der Säugetier-ARTs mit bakteriellen Toxinen (Müller-Dieckmann et al., 2002) (s. a. Abb. 4).

^{Abb. 4. ART1-ART7 sind membranständige ARTs bei Säugetieren und Vögeln. Strukturell nah verwandt sind sezernierte bakterielle Toxine aus Pseudomonas aeruginosa (exoS, exoT), Clostridium botulinum (C3, C2), Staphylococcus aureus (EDIN), Bacillus cereus (VIP2), und Salmonella entericae (SpvB). Entfernter verwandte Arts finden sich bei Phagen von Escherichia coli Phagen (ALT), bei Vibrio cholera (CT), Escherichia coli (LT), Borditella pertussis (PT), Bacillus sphaericus (MTX), einer Schmetterlingsraupe (Pieris rapae) und bei Stickstoff-fixierenden Bakterien (DRAT).}

Im Kontext des Immunsystems steuert die GPI-verankerte ART2 Überleben und Proliferation von T-Zellen (Adriouch et al., 2001). Zusammen mit der AG Seman, Paris, konnten wir zeigen, dass die ART2-vermittelte Aktivierung des zytoloytischen P2X7 Purinozeptors einen alternativen Weg zur Induktion der Apoptose von T-Zellen darstellt.(Seman, et al., 2003)

Unsere Ergebnisse deuten an, dass das ART-Substrat NAD (Nikotinamid Adenin Dinukleotid) von geschädigten Zellen freigesetzt und als "Gefahren-Signal" dient. Aktivierte T-Zellen stossen ART2 von der Zelloberfläche ab und werden dadurch resistent gegenüber der NAD-vermittelten Apoptose (Kahl et al., 2000). Wir vermuten, dass ART2 die Proliferation von unspezifischen Zellen (sog. "bystander lymphocytes") hemmt und damit die Vermehrung von gefährlichen, selbst-reaktiven Zellen verhindert.(Haag et al., 2003) Ein Störung dieses Schutzmechanismus kann die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen begünstigen (Ablamunits et al., 2001). In BB-Ratten und NOD-Maus Modellen für den autoimmunen Typ I Diabetes führt die Verabreichung von ART2-spezifischen Antikörpern in der Tat zu einer verstärkten Autoimmunreaktion.

Zusammen mit der AG Killeen; San Francisco, haben wir Maus-Stämme etabliert, denen ART-Gene fehlen (sog. " knock-out Mäuse"). T-Zellen dieser Mäuse können nicht mehr durch Zelloberflächen-ADP-Ribosylierung kontrolliert werden und zeigen dementsprechend eine spontane Hyperreaktivität (Ohlrogge et al., 2002). Derzeit untersuchen wir, inwiefern ART-Gendefekte die Fähigkeit des Immunsystems beeinflussen, angemessen auf Immunisierungen und Infektionen zu reagieren.

Von uns hergestellte rekombinante ARTs, monoklonale Antikörper und Enzym-Inhibitoren eröffnen neue Ansätze für die Modulation von Immunfunktionen, die auch zu neuen therapeutischen Prinzipien führen könnten. Interessante Anwendungsperspektiven bietet ferner unsere Entdeckung, dass der P2X7 Purinorezeptor über ADP-ribosylierte Proteine aktiviert wird.

In Zusammenarbeit mit den Arbeitsgruppen von F. Goldbaum (Buenos Aires, Argentinien) und A. Licea (Ensenada, Mexiko) untersuchen wir Möglichkeiten zur Gewinnung von rekombinanten Einzeldomänen-Antikörpern (single-domain antibodies, sdAbs) als spezifische Enzyminhibitoren. sdAbs sind die kleinsten von natürlich vorkommenden Antikörpern abgeleiteten antigenbindenden Einheiten. Sie können aus denjenigen Spezies gewonnen werden, welche die Fähigkeit entwickelt haben, Einzelketten-Antikörper (bestehend aus nur der schweren Kette des Immunglobulins) auszubilden. Dies ist im Verlauf der Evolution unabhängig voneinander bei Cameliden (Kamele und Lamas) und Elasmobranchiern (Haifische und ihre Verwandte) aufgetreten.
 

sdAbs besitzen Eigenschaften, die sie im Vergleich zu konventionellen Antikörpern besonders interessant machen: Sie lassen sich einfach und mit hoher Ausbeute rekombinant herstellen, da nicht die Expression zweier Polypeptidketten koordiniert werden muss; sie weisen eine hohe chemische und thermische Stabilität auf; sie können lange, fingerförmige, in das aktive Zentrum von Enzymen und andere biologische Kavitäten hineinragende Bindungsstellen bilden.

 
In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von F. Goldbaum in Buenos Aires nutzen wir Strategien zur DNA-Immunisierung und die Immunisierung mit rekombinanten Untereinheiten-Vakzinen zur Gewinnung von sdAbs aus Lamas und anderen neue-Welt Kameliden. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von A. Licea in Ensenada, Mexiko versuchen wir, sdAbs mittels der „phage display“-Technologie aus Bibliotheken immunisierter und nicht-immunisierter Haifische zu isolieren. Ziel dieser Arbeiten ist die Herstellung Enzym-inhibierender sdAbs gegen die ART2.2 ADP-Ribosyltransferase aus Kameliden und Haien.

Literaturauswahl (weitere Veröffentlichungen siehe unter Publikationen oder unsere Favorite Paper):

Übersichtsarbeiten:

Seman M, Adriouch S, Haag F, Koch-Nolte F.
"Ecto-ADP-ribosyltransferases (ARTs): emerging actors in cell communication and signaling."
Curr Med Chem. 2004 Apr;11(7):857-72.

F. Koch-Nolte, P.Reche, F. Haag & F. Bazan: "ADP-ribosyltransferases: plastic tools for inactivating proteins and small molecular weight targets"
J. Biotech. 92: 81-87 (2001)

F. Koch-Nolte, F. Haag, R. Kastelein, & F. Bazan: "Uncovered: The family relationship of a T cell membrane protein and bacterial toxins"
Immunol. Today 17: 402-406 (1996)

Originalarbeiten:

Peter Bannas, Sahil Adriouch, Sarah Kahl, Fenja Braasch, Friedrich Haag, and Friedrich Koch-Nolte
Activity and specifity of toxin-related mouse T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 depends on its association with lipid rafts
Blood, in press 2005 (published online ahead of print)

Christian Krebs, Sahil Adriouch, Fenja Braasch, Wolfgang Koestner, Edward H. Leiter, Michel Seman, Frances E. Lund, Norman Oppenheimer, Friedrich Haag, and Friedrich Koch-Nolte
CD38 controls ART2-catalyzed ADP-ribosylation of cell surface proteins
J Immunol in press 2005

Seman M, Adriouch S, Scheuplein F, Krebs C, Freese D, Glowacki G, Deterre P, Haag F, Koch-Nolte F.
"NAD-induced T cell death: ADP-ribosylation of cell surface proteins by ART2 activates the cytolytic P2X7 purinoceptor."
Immunity. 2003 Oct;19(4):571-82.

Krebs C, Koestner W, Nissen M, Welge V, Parusel I, Malavasi F, Leiter EH, Santella RM, Haag F, Koch-Nolte F.
"Flow cytometric and immunoblot assays for cell surface ADP-ribosylation using a monoclonal antibody specific for ethenoadenosine."
Anal Biochem. 2003 Mar 1;314(1):108-15. 

W. Ohlrogge, F. Haag, M. Nissen, H. Löhler, M. Seman, D. Littman, N. Killeen & F. Koch-Nolte:
"Generation and characterization of ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.1/ART2.2-deficient mice"
Mol. Cell. Biol. 22: 7535-7542 (2002)

C. Mueller-Dieckmann, H. Ritter, F. Haag, F. Koch-Nolte & G. Schulz:
"Structure of the ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 from rat"
J. Mol. Biol. 322: 687-696 (2002)

G. Glowacki, R. Braren,K. Firner, M. Nissen, M. Kühl, P. Reche, F. Bazan, M. Cetkovic-Cvrlje, E. H. Leiter, F. Haag & F. Koch-Nolte:
"The family of toxin-related ecto-ADP-ribosyltransferases in man and mouse"
Protein Science, 11: 1657-1670 (2002)

V. Ablamunits, M. Bridgett, T. Duffy, F. Haag, M. Nissen, F. Koch-Nolte & E.H. Leiter:
"Changing patterns of cell surface mono(ADP-ribosyl)transferase antigen ART2.2 on resting vs. cytopathically-activated T cells in NOD/Lt mice "
Diabetologia 44: 848-858 (2001)

S. Adriouch, W. Ohlrogge, F. Haag, F. Koch-Nolte & M. Seman:
"Rapid induction of naive T cell apoptosis by ecto-NAD: requirement for mono(ADP-ribosyl)transferase 2 and a downstream effector"
J. Immunol. 167: 96-203 (2001)

H. Otto, D. Teczan-Merdol, R. Girisch, F. Haag, M. Rhen & F. Koch-Nolte:
"The SpvB gene product of the Salmonella enterica virulence plasmid is a mono(ADP-ribosyl)transferase"
Mol. Microbiol. 37: 1106-1115 (2000)

S. Kahl, M. Nissen, R. Girisch, T. Duffy, F. Haag, E.H. Leiter & F. Koch- Nolte:
"Metalloprotease-mediated shedding of enzymatically active mouse ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 upon T cell activation"
J. Immunol. 165: 4463-4469 (2000)

F. Koch-Nolte, T. Duffy, M. Nissen, S. Kahl, N. Killeen, V. Ablumatis, F. Haag & E.H. Leiter:
"A new monoclonal antibody detects a developmentally-regulated ecto-ADP-ribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation"
J. Immunol. 163: 6014-6022 (1999)

F. Koch-Nolte, D. Petersen, S. Balasubramanian, R. Kastelein, J.F. Bazan, F. Haag, T. Willer, D. Kahlke, & H.G. Thiele: "Mouse T cell membrane proteins Rt6-1 and Rt6-2 are arginine/protein mono(ADPribosyl)transferases and share secondary structure motifs with ADP-ribosylating bacterial toxins"
J. Biol. Chem. 271, 7686-7693 (1996b)