Antibody Core Unit
Überblick Information und Kontakt Serviceleistungen Ausstattung/Technik Anmeldung
Durch die Integration der Antikörper Core Unit in das Institut für Immunologie in der Arbeitsgruppe Molekulare Immunologie bietet die Einheit Zugang zum vorhandenen wissenschaftlichen und technischen Know-How im Bereich Antikörperherstellung, speziell gegen Proteine in nativer Konformation mittels cDNA-Immunisierung. Die Einrichtung der Facility hat zum Ziel, Forscher bei der Entwicklung von Antikörpern zu beraten und die Herstellung von Poly- sowie Monoklonalen Antikörpern zu unterstützen, die spezifisch auf die wissenschaftliche Fragestellung zugeschnitten sind. Der Service beinhaltet die Aufbereitung der cDNA für die Immunisierung der Tiere, die Koordination der Immunisierung von Kaninchen, Ratten oder Mäusen sowie die Aufbereitung und initiale Testung der Immunseren. Im Fall von Ratten und Mäusen umfasst der Service ferner die Herstellung von monoklonalen Antikörpern (somatische Zellfusion, Screening und Subklonierung von Hybridomalinien, sowie die Isotypisierung der monoklonalen Antikörper und die Konjugation an Fluorochrome oder an eine Trägermatrix). Eine technische Assistentin ist innerhalb der Core Unit für die Umsetzung der Projekte zuständig.
Prof. Friedrich Nolte
Institut für Immunologie
Tel: 7410 53612
Email: nolte(at)uke.de
Alien Kruse
Technische Angestellte Antibody Core Unit
Tel.: 7410 54669
Email: a.kruse(at)uke.de
Herstellung von Polyklonalen Antikörpern
Zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern muss die cDNA in einem geeigneten eukaryotischen Expressionsvector bereitgestellt werden. Nach Immunisierung der Tiere mit der gelieferten cDNA wird der Titer des Immunserums über Zellkulturtests bestimmt. Nach 18 Wochen können Aliquots des Preimmun- und Immunserums zur Austestung geliefert werden. Innerhalb der folgenden drei Wochen entscheidet der Nutzer in Absprache mit der Core Unit, ob die Tiere zur Herstellung von Hybridomazelllinien oder zur Entblutung verwendet werden sollen.
Die Facility liefert Aliquots des Präimmunserums (ca. 0,5 ml bei Kaninchen, ca. 0,1 ml bei Ratten) und der finalen Blutung (ca. 30 ml bei Kaninchen, ca. 3 ml bei Ratten).
Herstellung von Monoklonalen Antikörpern
Fusionierung
Vier Tage vor der Fusion wird eine Boost Immunisierung der Tiere durchgeführt, vorzugsweise mit rekombinantem Protein oder mit HEK Zellen, die transient mit dem gelieferten cDNA Konstrukt transfiziert wurden. Aus den Tieren werden Milzzellen gewonnen, die mit SP2/0 Myeloma Zellen fusioniert werden. Dabei werden vier Aliquots der fusionierten Zellen in RPMI/20%FCS/10%DMSO tiefgefroren, jedes dieser Aliquots entspricht ca. 200- 2.000 wachsenden Hybridomazellklonen.
Screening
288 Klone (ein Aliquot der Fusionierung) werden auf Reaktionsfähigkeit mit CHO Zellen getestet, die transient mit dem Konstrukt transfiziert wurden, das zur Immunisierung verwendet wurde. Es werden die vier besten Klone geliefert (14 ml lebende Hybridoma Zellen).
Subklonierung
Nach der Subklonierung durch eingeschränkte Verdünnung werden 15 wachsende Subklone gepickt. Die Überstände werden auf Reaktionsfähigkeit mit CHO Zellen getestet, die transient mit dem Kontrukt transfiziert wurden, das zur Immunisierung verwendet wurde. Es werden die zwei besten Klone geliefert (14 ml lebende Hybridomazellen).
Isotypisierung
Die Bestimmung der Ig-Subklassen erfolgt mittels ELISA an einem Aliquot der Hybridoma Überstände.
Die gelieferte cDNA sollte unter der Kontrolle eines starken Promotors stehen (z.B. CMV, pgk). Die Erfolgsrate ist für Membranproteine und sekretierte Proteine höher als für intrazelluläre Proteine. In vielen Fällen können jedoch intrazelluläre Proteine und/oder definierte Subdomänen von intrazellulären Proteinen in Membranproteine verwandelt werden, indem man sie in einen "Display"-Vektor kloniert (z.B. zwischen ein Leaderpeptid und eine Transmembrandomäne). Die Antibody Core Unit kann einen hierfür geeigneten Vektor liefern, der mit einem N-terminalen FLAG-tag ausgestattet ist, so dass die erfolgreiche Expression in transient transfizierten Zellen verifiziert werden kann (bitte hierzu das beiliegene MTA ausfüllen).
Die Erfolgsrate der Immunisierung beträgt
o ca. 80% im Fall von Membran und sekretorischen Proteinen
o ca. 50% im Fall von cytosolischen Proteinen
o ca. 30% im Fall von "blinden" Immunisierungen mit einem uncharakterisierten Expressionsvektor, der den vorhergesagten vollständigen Open Reading Frame enthält
Zur Immunisierung der Tiere werden in der Facility eine Prime- und drei Boost-Immunisierungen durchgeführt.
Für die Immunisierungsreaktion werden die gelieferten Plasmide an Goldpartikel konjugiert und zusammen mit einem Adjuvanz über ballistische Transfektion ins Tier eingebracht.
Die Spezifität und der Titer des erhaltenen Serums wird über die Austestung der Reaktionsfähigkeit des Serums durch Immunfloureszenzanalysen mit transient transfizierten CHO Zellen bestimmt. Diese Zellen werden hierzu mit einem cDNA Konstrukt ko-transfiziert, das für ein kernlokalisiertes GFP (Green Flourescent Protein) kodiert. Das Serum wird als spezifisch beurteilt, wenn es GFP transfizierte Zellen aber nicht Kontrollen anfärbt.
Bei Interesse an einer Antikörperproduktion schicken Sie bitte einen ausgefüllten Anmeldungsbogen per Email an Prof. Nolte. Bitte beachten Sie auch die Nutzungsordnung der Antikörper Core Unit.
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