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In vitro Herstellung von hyalinem Knorpel zur chirurgischen Behandlung von Gelenkflächenschäden. (tissue engineering)
Der hyaline Knorpel des Menschen ist nach Schädigung nicht in der Lage, sich funktionell zu regenerieren. Statt dessen wird in der Regel biomechanisch minderwertiger Faserknorpel gebildet. Ein therapeutischer Ansatz zur funktionellen Wiederherstellung besteht im chirurgischen Ersatz des geschädigten Gewebes durch autologes gesundes Gewebe. Soll das benötigte osteochondrale Implantat nicht wie bisher an anderer Stelle dem Gelenk des Patienten entnommen werden, bleibt nur die in vitro Herstellung mit den Methoden des tissue engineering.
Da seit langem bekannt ist, dass frisch isolierte Chondrocyten (auch von erwachsenen Individuen) noch die Fähigkeit zur Bildung von hyalinem Knorpel zeigen, erscheint dieser Ansatz prinzipiell als Erfolg versprechend. Die Lösung der in diesem Zusammenhang noch bestehenden Probleme ist Ziel des aktuellen Projektes. Im wesentlichen konzentrieren wir uns in unserer Arbeitsgruppe auf die beiden folgenden Aufgaben:
1. Die Bereitstellung einer ausreichenden Anzahl differenzierter Chondrocyten:
Prinzipiell stehen zwei Quellen für die Gewinnung der Zellen zur Verfügung,
a) differenzierte primäre Chondrocyten durch Isolierung aus einer Knorpelbiopsie und
b) mesenchymale Stammzellen aus einer Knochenmarksprobe. Beide Wege werden in unserer Arbeitsgruppe verfolgt.
a) Aus Knorpelgewebe isolierte Chondrocyten verlieren bei der zur Vermehrung notwendigen in vitro Kultivierung über mehrere Passagen nach und nach ihren differenzierten Phänotyp, ein Vorgang, den man als Dedifferenzierung bezeichnet. Unsere Bemühungen gelten daher der Suche nach einer Möglichkeit, die de-differenzierten Zellen nach der Proliferation wieder zu re-differenzieren. Ausgehend von der Beobachtung, dass das Verhalten der Zellen im wesentlichen von der Zusammensetzung der von ihnen empfangenen extrazellulären Signale bestimmt wird, wenn die Versorgung der Zellen nicht limitiert, haben wir ein Drei-Phasen-Modell entwickelt, dass den Zellen durch spezifische Optimierung der Kulturbedingungen in drei nacheinander folgenden Zeitsbschnitten Gelegenheit zur Ausübung der drei Funktionen Proliferation, Differenzierung und Matrixsynthese gibt. Neben der Zugabe unterschiedlicher Wachstumsfaktoren können so auch die äußeren Kulturbedingungen dem Bedarf angepasst werden. So läuft nur die Proliferation in konventioneller Monolayer-Kultur. Die Re-Differenzierung wird dagegen mit in Alginat-Beads eingebetteten Zellen vorgenommen, während die Matrixsynthese nach Sedimentation auf einem knochenähnlichen Träger stimuliert wird (siehe unten).
b) Eine Fraktion mesenchymaler Stammzellen wie sie mittels Percollgradienten und selektiver Adhärierung an Polystyroloberflächen aus dem Knochenmark potenzieller Patienten angereichert werden kann, ist ebenfalls prinzipiell zur in vitro Herstellung von hyalinem Knorpel geeignet. Auch hier wenden wir das Konzept des Drei-Phasen-Modells an, wobei allerdings für die beiden ersten Phasen andere spezifische Bedingungen erarbeitet werden müssen. Hinsichtlich der Proliferation ist hier in erster Linie das Problem der spontanen, vorzeitigen und daher unerwünschten Differenzierung zu lösen, um eine erhöhte Heterogenität der Zellpopulation und damit erniedrigte Proliferationsrate zu vermeiden. Zur Differenzierung in Alginat-Beads wird ein eigenes Protokoll mit angepasster Zusammensetzung der Wachstumsfaktoren entwickelt.
2. Die Züchtung eines Gewebes auf einem knochenähnlichen Träger:
Unabhängig von der gewählten Quelle - adulte Chondrocyten oder mesenchymale Stammzellen - sollten nach der Differenzierungsphase Zellen zur Verfügung stehen, die den primären Chondrocyten möglichst weitgehend ähneln. Daher soll zur Stimulierung der eigentlichen Knorpelbildung in vitro ein gemeinsames Protokoll erarbeitet werden.
Ziel ist die Herstellung osteochondraler Sandwich-Implantate, da alternative Methoden zur nachhaltigen Fixierung von Knorpelgewebe im Gelenk zur Zeit nicht bekannt sind. Eingesetzt wird dazu eine Technik zur Sedimentation von Zellen auf einen Haydroxylapatit-Träger (HAP) mit 4-6 mm Durchmesser. Kernproblem bei der Knorpelzüchtung auf dem HAP-Träger ist es, einerseits die aufsedimentierten Chondrocyten möglichst fest auf der Oberfläche zu verankern und andererseits die Wirkung mitogener Signale zu verhindern. Hier werden zwei Strategien verfolgt. Nach der ersten wird den durch den Kontakt mit dem HAP-Träger mitogen stimulierten Zellen erlaubt, zunächst eine multizelluläre Schicht zu bilden, um die Zellen im folgenden durch Applikation geeigneter chondrogen wirkender Wachstumsfaktoren ( IGF-1, TGFß1) auf die Matrixsynthese umzuschalten (Switch-Technik). Die Alternative besteht in der Beschichtung der HAP-Oberfläche mit einem gleichermaßen fest adhärierenden wie chondrogen wirkenden Primer. Durch kovalente Modifizierung mit Integrinliganden konnte das Ziel nicht erreicht werden. Zur Zeit wird statt dessen geprüft, in wie weit sich Co-Kulturen mit Chondrocyten oder mesenchymale Stammzellen in einem geeigneten Differenzierungs-Status hier einsetzen lassen.
Analytik: Der Erfolg der ausreichenden Stimulierung der Proliferation, Differenzierung und Matrixsynthese läßt sich verlässlich nur durch Analyse des Endproduktes, des gebildeten Knorpels beurteilen. Qualitativ ist eine hoher Kollagen Typ II/TypI-Quotient und eine ausgewogene Menge an Proteoglykanen (bezogen auf die DNA) wichtig. Weitere Parameter sind Zellularität und Wassergehalt. Quantitativ ist die auf dem Träger erreichbare Schichtdicke entscheidend, die sich an dem in vivo vorkommenden Gelenkknorpel orientiert (>2mm). Zur Zeit werden Phasenspezifische Marker analysiert, die es erlauben sollen, auch den Erfolg der Differenzierung schon vor Beginn der Matrixsynthese-Phase zu beurteilen.
Biomembranmimikrie für medizinische Oberfläche
GKSS Forschungszentrum Geesthacht, Nr. 7.T1.00.G.01-HS 2
1 BAT¾ für 3 Jahre,
Verbrauchsmittel € 62.000,- für 3 Jahre (April 2003-März 2006)
Human mesenchymal stem cells are not of donor origin in patients with severe aplastic anemia who underwent sex-mismatched allogeneic bone marrow transplant. Stute N, Fehse B, Schroder J, Arps S, Adamietz P, Held KR, Zander AR. J Hematother Stem Cell Res. 2002 Dec;11(6):977-84. Abstract...
RGD-peptides for tissue engineering of articular cartilage. Jeschke B, Meyer J, Jonczyk A, Kessler H, Adamietz P, Meenen NM, Kantlehner M, Goepfert C, Nies B. Biomaterials. 2002 Aug;23(16):3455-63. Abstract...
Kultivierung von dreidimensionalen Knorpelimplantaten in einem Bioreaktorsystem unter Druckbelastung. Nagel Heyer S., Schmid K., Feyerabend F., Goepfert C., Adamietz P., Meenen N.M., Jeschke B., Pörtner R. Der Unfallchirurg, 66. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie e.V.,(2002) Abstracts: 368 369.
Process strategies for bioreactor cultures of threedimensional cartilage implants. Nagel Heyer S., Feyerabend F., Goepfert C., Adamietz P., Meenen N.M., Jeschke B., Pörtner R. Tissue Engineering Vol. 7 No. 5: 621, Abstracts
of the first biennal european tissue engineering society international.
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