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Arbeitsgruppenleiter: Prof. Dr. rer. nat. Kerstin Kutsche
Mitarbeiter: I. Jantke, F. Kortüm, V. van Rahden
Mit der Verfügbarkeit der humanen Genomsequenz wird die Identifizerung von menschlichen Krankheitsgenen erheblich erleichtert. Dennoch wurde bis heute nur ein Bruchteil aller Gene für die über 3000 monogenen Erkrankungen identifiziert.
Chromosomale Rearrangements wie Inversionen und Translokationen kommen mit einer Häufigkeit von etwa 3 in 1000 Lebendgeburten vor und zeichnen sich cytogenetisch in der Regel durch keinen offensichtlichen Verlust an genetischem Material aus. In den meisten Fällen sind die Träger von konstitutionellen Rearrangements phänotypisch unauffällig. Befindet sich jedoch bei einem vorliegenden chromosomalen Rearrangement einer der beiden Bruchpunkte in einem Gen oder einer regulatorischen Kontrollregion, kann es zu einem auffälligen klinischen Erscheinungsbild, z.B. einer syndromalen Erkrankung, kommen. Die physikalische Kartierung der jeweiligen Bruchpunktregionen und die daraus resultierende Identifizierung von Genen kann daher zum Auffinden neuer Krankheitsgene führen.
Wir bearbeiten in unserer Arbeitsgruppe mehrere chromosomale Rearrangements, die bei den jeweiligen Patienten de novo vorliegen. Gene in den Bruchpunktregionen gelten als Kandidatengene für den vorliegenden Krankheitsphänotyp. Daher grenzen wir die Bruchpunktregionen mit Hilfe der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung unter Verwendung von genomischen DNA-Sonden wie BAC- und Fosmid-Klonen zunächst ein und wenden im Anschluss daran verschiedene molekulargenetische Methoden an, um die Bruchpunkte auf molekularer Ebene zu bestimmen (1,2,3,4,5).
Für die Bestätigung eines neuen Krankheitsgens ist die Identifizierung mehrerer pathogener Mutationen zwingende Voraussetzung. Deswegen führen wir bei Patienten mit gleichem oder ähnlichem Krankheitsbild wie das des Indexpatienten (mit chromosomalem Rearrangement) eine Mutationsanalyse von in den Bruchpunktregionen liegenden Genen durch, um Punktmutationen bzw. kleinere Rearrangements (Deletionen, Duplikationen oder Inversionen) zu identifizieren. Mit Hilfe der hier genannten Techniken haben wir eine X/21-Translokation bei einem männlichen Patienten mit schwerer geistiger Behinderung auf molekularer Ebene charakterisiert und ein direkt unterbrochenes Gen, ARHGEF6, identifiziert. Zusätzlich konnten wir bei vier betroffenen männlichen Patienten einer großen holländischen Familie eine weitere Mutation in ARHGEF6 (oder alphaPIX) feststellen, so dass ARHGEF6 damit als Krankheitsgen für die X-chromosomal vererbte, unspezifische geistige Behinderung bestätigt wurde (6).
Mit der Identifizierung des für eine bestimmte erblich bedingte Erkrankung verantwortlichen Gens stellen sich verschiedene Fragen:
In unserer Arbeitsgruppe untersuchen wir zur Zeit vier Proteine, deren Funktionsveränderungen bei verschiedenen Erkrankungen eine Rolle spielen. Mittels diverser biochemischer und zellbiologischer Analysemethoden sollen die o.g. Fragen beantwortet werden, um so Einblicke in die pathogenetischen und –biologischen Mechanismen der jeweiligen Erkrankung zu erhalten.
X-chromosomal vererbte unspezifische geistige Behinderung
Mutationen im ARHGEF6 (alphaPIX)-Gen führen zu einer Form der X-chromosomal vererbten unspezifischen geistigen Behinderung (NS-XLMR) beim Menschen (1). ARHGEF6 codiert für einen Guanosin-Nukleotid-
Um die komplexen ARHGEF6-abhängigen Signaltransduktionswege aufzuklären, wurde von uns das Sos-Recruitment-System (Hefe-Zwei-Hybrid-System) verwendet, und es gelang uns, u.a. PARVB (beta-Parvin) und ARHGEF7 (betaPIX) als Interaktionspartner von ARHGEF6 zu identifizieren. Mittels GST-Präzipitationen konnten wir zeigen, dass die Interaktionen der aberranten Proteine ARHGEF6 Δ396-776 und ARHGEF6 Δ56-83, welche durch Mutationen in ARHGEF6 bei Patienten mit NS-XLMR resultieren, mit PARVB und ARHGEF7 gestört sind (Abb. 1a).
In Immunfluoreszenzanalysen fand sich eine konzentrierte Lokalisation des ARHGEF6-Proteins an der Zellperipherie. Im Gegensatz dazu zeigten die beiden mutierten Proteine eine völlig andere Verteilung: ARHGEF6 Δ56-83 kommt in einem punktförmigen Muster innerhalb des Zytoplasmas vor, während sich ARHGEF6 Δ396-776 hauptsächlich im Zellkern befindet (Abb. 1b).
Schließlich fanden wir, dass ARHGEF6 in frühen Integrin-haltigen Komplexen an der Zellperipherie lokalisiert ist (Abb. 1c)(2). Diese Komplexe sind frühe fokale Adhäsionsstellen, deren ständiger Auf-, Ab- und Umbau die wichtigsten Voraussetzungen für Zellmorphologie verändernde Prozesse, wie z.B. Zellausbreitung und Zellmigration, sind. Wir beobachteten, dass die ektopische Expression von ARHGEF6 die Bildung von multiplen charakteristischen zellulären Fortsätzen während der Integrin-abhängigen Zellausbreitung induziert (Abb. 1c).
Unsere Daten geben erste Hinweise darauf, dass eine Störung der Integrin-abhängigen Regulation von Rho-GTPasen durch mutiertes ARHGEF6 möglicherweise zu einer unreifen oder veränderten neuronalen Morphologie, die mit einer geistigen Behinderung einhergehen könnte, führen kann. In Übereinstimmung damit konnte durch verhaltensbiologische Untersuchungen der von uns generierten Arhgef6-defizienten Mäuse ein gestörtes emotionales Verhalten (erhöhter Explorationsdrang) und eine veränderte Verarbeitung räumlicher Informationen (auffälliges Schwimmverhalten und penetrantes Suchen an der ursprünglich positionierten Plattform im Morris Water Maze-Test) festgestellt werden.
Costello-Syndrom
Beim Costello-Syndrom (CS) handelt es sich um ein angeborenes Fehlbildungssyndrom, das durch eine schwere postnatale Gedeihstörung, eine grobe Fazies, überschüssige und weiche Haut mit tiefen Palmar- und Plantarfurchen, geistige Behinderung, Herzfehler und eine Tumorprädisposition charakterisiert ist. Bemerkenswerterweise führen aktivierende, heterozygot vorliegende Keimbahnmutationen in HRAS zu diesem Erkrankungsbild. HRAS (H-Ras oder Ha-Ras) gehört zur Gruppe der monomeren GTPasen, die als molekulare Schalter in der Zelle wirken, indem sie zwischen einem aktiven, GTP-gebundenen und einem inaktiven, GDP-gebundenen Zustand wechseln können. Diverse zelluläre Signaltransduktionskaskaden wie der RAF-MEK-ERK- und der PI3K-PKB/AKT-Signalweg sind von der Aktivität von HRAS abhängig. Wir verwenden primäre Hautfibroblasten von Patienten mit CS als Modellsystem, um die dieser Erkrankung zugrunde liegenden molekularbiologischen Pathomechanismen aufzuklären.
MLS-Syndrom
Das MLS- („microphthalmia with linear skin defects”), oder im deutschsprachigen Raum auch als MIDAS- (Mikrophthalmie, dermale Aplasie und Sklerocornea) Syndrom bezeichnet, ist eine X-chromosomal-dominant vererbte Erkrankung, die mit männlicher Letalität in utero einhergeht. Bei der Mehrzahl der Patientinnen mit MLS-Syndrom liegt eine cytogenetisch sichtbare, terminale Deletion am kurzen Arm eines der beiden X-Chromosomen vor. Die Analyse von X-chromosomalen Rearrangements bei Patientinnen mit MLS-Syndrom sowie bei solchen mit keinem MLS-Phänotyp führte zur Eingrenzung eines etwa 600 Kb großen Bereichs in der Region Xp22.2, in dem sich die drei Gene MID1, HCCS, und ARHGAP6 befinden. Wir konnten erstmals bei zwei Patientinnen mit MLS-Syndrom und einem offensichtlich normalen Karyotyp eine heterozygote de novo Missense (p.R217C)- bzw. Nonsense (p.R197X)-Mutation im HCCS-Gen identifizieren. HCCS kodiert für die mitochondrielle Holocytochrom-c-Synthase, welche als Hämlyase die kovalente Bindung von Häm an die Vorläuferform der beiden Cytochrome c und c1 (Apocytochrom c und c1) katalysiert.
Mit Hilfe verschiedener funktioneller Tests konnten wir zeigen, dass die beiden von uns identifizierten Mutationen im HCCS-Gen mit großer Wahrscheinlichkeit zu einem Funktionsverlust der entsprechenden Proteine führen. So waren die beiden mutanten Proteine HCCS R217C und das C-terminal trunkierte HCCS Δ197-268 im Gegensatz zum Wildtyp-Protein nicht mehr in der Lage, das Wachstum eines Saccharomyces cerevisiae-Stamms, welcher für das HCCS-Ortholog Cyc3p defizient ist, unter respiratorischen Bedingungen zu ermöglichen (Abb. 2a).
Mittels Immunfluoreszenzanalysen stellten wir fest, dass ektopisch exprimiertes HCCS Δ197-268 nicht mehr in die Mitochondrien gelangt, wohingegen HCCS R217C und das Wildtyp-Protein eine Lokalisation in den Mitochondrien aufweisen (Abb. 2b).
Zusammengenommen geben diese Daten Hinweise darauf, dass der Funktionsverlust der Holocytochrom-c-Synthase zum MLS-Syndrom führt. Das durch die Hämlyase HCCS synthetisierte reife Cytochrom c spielt als Elektronencarrier bei der oxidativen Phosphorylierung (Atmungskette) und auch als proapoptotischer Faktor beim programmierten Zelltod eine bedeutende Rolle. Daher vermuten wir, dass Defekte in beiden biologischen Prozessen zu dem ungewöhnlichen Phänotyp der Patienten mit MLS-Syndrom führen (5). Weitergehende funktionelle Untersuchungen sollen folgen, um dieser Annahme nachzugehen.
Lowe-Syndrom
Das Lowe-Syndrom ist eine seltene, X-chromosomal vererbte Erkrankung, die durch geistige Behinderung, kongenitale Katarakt und eine renale Tubulopathie charakterisiert ist. Mutationen im OCRL-Gen sind ursächlich für diese Erkrankung. OCRL kodiert für eine Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat [PtdIns(4,5)P2] spezifische 5-Phosphatase, die am Golgi-Apparat und am Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) lokalisiert ist. Die bisherigen Daten lassen eine Funktion von OCRL1 beim vesikulären Transport und hier insbesondere beim gerichteten, Clathrin-vermittelten Proteinaustausch von Endosomen zum TGN vermuten. Bisher davon abzugrenzen ist eine zweite Funktion von OCRL1, die im Zusammenhang mit der Reorganisation des Aktinzytoskeletts steht. So interagiert OCRL1 mit der zur Familie der Rho-GTPasen gehörigen GTPase Rac1 und beschleunigt deren GTP-Hydrolyse. Aktiviertes Rac1 ist zudem für die Lokalisation von OCRL1 an der Plasmamembran verantwortlich, so dass in Rac-induzierten Lamellipodien und Membranauffaltungen die PtdIns(4,5)P2-5-Phosphatase-Aktivität von OCRL1 eine wichtige Rolle zu spielen scheint.
Wir wollen in diesem Projekt verschiedene Aspekte des OCRL1-Proteins untersuchen, um dessen Funktion sowohl im Hinblick auf den vesikulären Transport innerhalb der Zelle als auch bei der Reorganisation des Aktinzytoskeletts besser zu verstehen. Hierfür stehen uns sechs Fibroblasten-Zelllinien von Patienten mit Lowe-Syndrom und nachgewiesener OCRL-Mutation sowie mittels siRNA erzeugte OCRL1-depletierte Zellen zur Verfügung. Dieses Projekt wird im Rahmen des Graduiertenkollegs 1459 gefördert.
